四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

董 维,陈安均,韩国全,蒲 彪,罗 惟,侯晓艳

(四川农业大学食品学院,四川雅安 625014)

四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

董 维,陈安均*,韩国全,蒲 彪,罗 惟,侯晓艳

(四川农业大学食品学院,四川雅安 625014)

目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据GenBank中亚硝酸盐还原酶(NIR)基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒pMD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体pET-32a(+)中,获得重组表达载体pET-32a-nir,构建成功后转化到E.coliBL(DE3)中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到E.coliBL(DE3)中,表达产物有酶活。

亚硝酸盐还原酶，克隆,基因表达,植物乳杆菌

四川泡菜是以新鲜蔬菜为原料,在以乳酸菌为主要菌群的作用下经厌氧发酵而形成的一种发酵食品[1-2]。泡菜对降低人体内的胆固醇含量、预防高血压等疾病有一定的作用[3-4]。然而在新鲜蔬菜发酵过程前期会出现一个 “亚硝峰”[5-6],有的远超过我国腌制食品中30 mg/kg亚硝酸盐的标准[7]。而亚硝酸盐的危害主要是使血红蛋白失去了携带氧的能力[8],并且亚硝酸盐容易生成有很强的致癌作用的亚硝胺化合物[9]。大量文献报道出乳酸菌具有降解亚硝酸盐的能力[10-13],其中杜晓华[14]等从四川泡菜中筛选出降解亚硝酸盐乳酸菌,其降解率高达90%。

随着分子技术的发展,运用基因克隆的技术,通过对亚硝酸盐还原酶保守序列进行分析等,设计引物,pcr扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接转化,并导入大肠杆菌中,诱导表达,产生亚硝酸盐还原酶,从而来降解亚硝酸盐,为进一步的亚硝酸盐还原酶工业化生产提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)由四川农业大学食品学院提供;TaKaRa T-Vector pMD 19(Simple)克隆载体,pET-32a(+)表达载体购自大连宝生物工程有限公司;大肠杆菌DH5a,大肠杆菌BL21(DE3),TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒,DL2000 DNA Marker,普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,限制性内切酶Bgl II,Xho I,2x Taq PCR Master-Mix购自北京TIANGEN生物公司等。

DNP-9126型恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;SW-CJ-1F型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;WH-2微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司;BCD-216TXN海尔冰箱 青岛海尔有限公司;ZD-85气浴恒温振荡器 四川新科仪器有限公司;冷冻高速离心机 Thermo SCIENTIFIC;C1000 Thermal Cycler PCR仪 美国Bio-RAD公司;SUB-CELL GT小型水平电泳槽 美国Bio-RAD公司;Gel Doc XR+凝胶成像分析系统 美国Bio-RAD公司;DYCZ-240型电泳仪及电源 北京市六一仪器厂;UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司。

1.2 菌种DNA的提取

利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取植物乳杆菌的DNA。

1.3 nir基因的克隆

参考LactobacillusplantarumWCFS1全部基因序列设计引物,F1上游引物:5′-CCAGATCTGGGT ACCATG AGTCAAAGCTTATGGCAA-3′(下划线为Bgl II的酶切位点),R1下游引物:5′-GCGGCCGCA CTCGAGCATTAATTCCGT ACACT GTTTGC-3′(下划线为XhoI的酶切位点)。PCR扩增体系(25 μL):dd H2O 9.5 μL,Mix 12.5 μL,,植物乳杆菌DNA 1 μL,上游引物、下游引物各1 μL,混匀。反应条件:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。吸取5 μL PCR产物,通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测[20]。在紫外灯下切下目的片段,利用胶回收试剂盒回收目的片段,与T-Vector pMD19(simple)载体连接,转化至大肠杆菌DH5α中,将转化菌涂布含Amp 100,24 mg/mL IPTG和20 mg/mL X-Gal的LB平板上[21],筛选阳性克隆子,并进行扩大培养。提取重组质粒DNA,进行双酶切鉴定。将鉴定正确的克隆子送到华大基因进行测序,测序的结果用DNAStar软件分析并于GenBank中发表的基因进行序列比对。

1.4 重组质粒pET-32a-nir的构建

将克隆的质粒和质粒pET-32a分别用限制性内切酶切开,酶切体系BamH I 1 μL、XhoI 1 μL、缓冲液2 μL、重组质粒8 μL、ddH2O 8 μL、总体积20 μL,水浴37 ℃反应4 h,纯化回收,用DNA快速连接试剂盒进行连接反应,把转化液涂布于相应的LB的培养基中,同时以空载体为对照。挑取阳性克隆子进行扩大培养,提取DNA,并进行PCR鉴定和酶切鉴定[20-21]。并把鉴定正确的克隆子送华大基因测序。

1.5 重组菌株在大肠杆菌中的表达

将构建好的表达菌株接种到LB/Amp液体培养基中,37 ℃振荡培养12 h,然后分别按1%的菌液量接种于含有50 mL LB/Amp液体培养基的三角瓶中,37 ℃振荡培养6 h(菌液OD600达到0.4～0.6)时[21],加入IPTG使最终浓度为1 mmol/L,37 ℃诱导时间4 h行诱导表达;同时以空载体和未诱导作对照。取样10 mL,12000 r/min离心2 min,弃去上清液,沉淀加入菌体沉淀重悬于5 mL预冷的PBS缓冲液(pH7.4)中,超声裂解3 min,每次3 s,间隔5 s,功率400 W。然后 12000 r/min,4 ℃,离心20 min,上清液为粗酶液[20-21],进行SDS-PAGE电泳检测,记录并分析结果。

1.6 重组菌株酶活的测定

用GENMED细菌亚硝酸盐还原酶总活性比色法定量检测试剂盒来测定酶活,其原理:基于底物亚硝酸盐,在人工电子供体还原型甲基紫精的参与下,受到亚硝酸盐还原酶的催化产生氨或一氧化氮,同时还原型甲基紫精转化为氧化型甲基紫精,通过其吸收峰值的变化(600 nm波长),来定量分析亚硝酸盐还原酶的总活性[22],步骤和公式详见试剂盒说明书。酶活测定的数据采用Excel进行整理,以平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 目的基因扩增及序列分析

以植物乳杆菌DNA为模版,利用PCR技术扩增出nir目的基因,用1%琼脂糖凝胶电泳分析,结果如图1:可以明显看出1,2,3目的基因扩增的片段在1200 bp到2000 bp之间有单一的条带,条带大小与预期目的片段大小一致,而4是阴性对照没有条带。

图1 nir目的基因PCR扩增产物鉴定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplificationof the targeted nir gene注:M为DNA分子量标准;1,2,3为PCR扩增产物;4为阴性对照。

2.2 T克隆的双酶切鉴定及序列比对

将构建好的T克隆阳性菌株,扩大培养,提取质粒DNA后,经PCR鉴定正确后,再用双酶切鉴定,把酶切后的产物用琼脂糖电泳检测显示:从图2中可以明显看出,重组质粒明显被切分为两个片段,在2000～3000 bp之间的是T-Vector pMD19基因片段,而在1200～2000 bp之间的是nir目的基因片段,而对照组(没有导入目的片段)则只有一个条带,即T-Vector pMD19被酶切的片段。这与预期酶切产物片段大小相符。

图2 T克隆的双酶切鉴定Fig.2 Identification of T plasmidby double restriction digestion注:M为DNA分子量标准;1,2为双酶切产物;3为阴性对照。

把鉴定正确的阳性克隆子送去测序,测序结果经软件分析得出:nir基因的开放阅读框碱基长度为1638 bp,经NCBI Blast的结果:与其它nir(JX434610.1)的最高同源性为99%,找到nir基因的核苷酸序列及编码的氨基酸序列(如图3)。证明本次实验成功克隆出nir基因。

图3 nir基因的核苷酸序列及编码的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide sequences anddeduced amino acid sequences of nir genes注:下划线部分为引物序列;方框为限制性内切酶序列;斜体为非编码序列。

2.3 重组质粒pET-32a-nir的双酶切鉴定

把构建好的重组质粒进行PCR鉴定后,再双酶切鉴定,电泳检测结果如下(见图4):1,2为重组质粒(导入目的基因)的双酶切产物,可以明显看出重组质粒被切分成两个大小不同的条带:在5000～7500 bp之间的是酶切后的pET-32a(+)基因片段,而在1000～2500 bp之间的nir基因片段。对照组3,4只存在pET-32a(+)基因片段,不存在目的基因片段。这与预期产物片段结果一致,把酶切鉴定正确的重组质粒送去测序,对测序结果进行分析,结果表明成功构建了表达质粒pET-32a(+)-nir。

图4 重组质粒pET-32a-nir的双酶切鉴定Fig.4 Double restriction enzyme digestionof recombinant plasmid pET-32a-nir注:M为DNA分子量标准;1,2为重组质粒的双酶切;3,4为对照组。

2.4 重组菌株蛋白质SDS-PAGE电泳检测

把构建好的重组表达菌株接种到LB/Amp的液体培养基中,培养5 h后,加入工作浓度为1 mmol/L的IPTG、37℃诱导表达4 h。取IPTG诱导后的菌液,离心获得菌体,经洗涤,破碎后取总蛋白经SDS-PAGE电泳检测,结果如图5所示:

图5 重组蛋白质SDS-PAGE电泳检测Fig.5 Electrophoresis of SDS-PAGEof the recombinant expression product注:M为蛋白质分子量标准;1为空载;2为诱导表达菌株;3为未诱导表达菌株。

从图5可以明显看出,诱导表达的菌株总蛋白样品中存在一条在66 ku和97 ku条带之间的明显条带(即箭头所指的条带),而对照组中的空载和未诱导的表达菌株没有条带,利用在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)预测重组蛋白的分子量为80 ku,实验结果与预测值一致,从而证明构建好的原核表达菌株能够诱导表达目的蛋白。

2.5 酶活力的测定结果

用细菌亚硝酸盐还原酶活性检测试剂盒对重组质粒诱导表达产物、非诱导表达产物和空载的酶活性进行测定。非诱导和空载的检测结果显示5 min内OD600值没有明显变化,而重组质粒诱导表达产物的样品则有明显的变化(结果见图6)。先用BCA蛋白定量算出不同样品的蛋白样品浓度,再根据公式算出重组表达菌株酶活力为4.2 U/mg(U=微摩尔亚硝酸盐/分钟)。

图6 表达产物酶活测定Fig. 6 Enzyme activity of expression product

3 结论与讨论

亚硝酸盐还原酶存在于大量的植物和微生物中,但大多数为胞内酶,在细胞外的效果不好,并且亚硝酸盐还原酶是氧化还原酶,需要电子传递体的参与,从而限制了亚硝酸盐还原酶的应用[23]。本文从研究四川传统泡菜中亚硝酸盐的变化中,发现乳酸菌具有降解亚硝酸盐的能力,张庆芳[13]等研究发现,乳酸菌降解主要分为酸降解和酶降解。其中有学者从乳酸菌中分离纯化出亚硝酸盐还原酶,并进行了酶学性质的研究[24]。实验所用的植物乳杆菌经发酵培养,离心,破壁得到粗酶液,用盐酸萘乙二胺法检测,初步认定该菌株含有亚硝酸盐还原酶的基因[22]。通过分子克隆技术,构建和表达了重组目的蛋白,并对该蛋白用细菌亚硝酸盐还原酶总活性试剂盒进行测定,结果发现目的蛋白具有降解亚硝酸盐的能力。从而证明克隆的亚硝酸盐还原酶基因是正确的,也说明实验所用的植物乳酸菌确实含有亚硝酸盐还原酶的基因。

重组表达的目的蛋白酶活力不高,需对重组表达菌株诱导表达的条件进行分析,主要从诱导时间、IPTG浓度、温度等方面进行优化。对诱导表达出来的粗酶液,重组蛋白质的纯化,并对酶学性质进行分析,确定最佳酶活反应条件,从而测定亚硝酸盐还原酶的酶活力。

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Expression of nitrite reductase gene fromLactobacillusplantarumfrom Sichuan pao cai

DONG Wei,CHEN An-jun*,HAN Guo-quan,PU Biao,LUO Wei,HOU Xiao-yan

(College of Resources and Environment,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Objective:To clone and the nitrite reductase gene(nir)fromLactobacillusplantarumand detect the enzyme activity. Methods:The primers were designed according to nir sequence in GenBank. The DNA fromLactobacillusplantarumwhich came from Sichuan pao cai was extracted. The nir gene was amplified by PCR,it was cloned into T vector pMD19. The recombinant plasmid was constructed for analyzing the sequence homology. The plasmid by double enzyme digestion was connected to the expression plasmid pET-32a(+). It was constructed the recombinant plasmid pET-32a-nir. The plamid was transformed intoE.coliBL(DE3)in order to express the research. The new host bacteria grew with IPTG induction,the cell was broken with ultrasonic. The crude enzyme was extracted and the enzyme activity was measured. Result:The purpose of cloned gene length was 1638 bp. A kind of recombinant protein with the molecular weight of 80 ku was obtained. The enzyme activity was 4.2 U/mg. Conclution:The nitrite reductase gene fromLactobacillusplantarumwas successfully cloned and transformed inE.coliBL(DE3),the expression product had enzyme activity.

nitrite reductase;clone;gene expression;Lactobacillusplantarum

2014-10-23

董维(1988-)，男，在读研究生，研究方向：农产品加工与贮藏，E-mail：784292718@qq.com。

*通讯作者:陈安均(1970-)，男，博士，副教授，研究方向：园艺产品加工与贮藏，E-mail：591919465@qq.com。

国家自然科学基金项目(31171726)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD31B04)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0143-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.022