山药硒多糖对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

滕 杨,谷 娜,罗时旋,李建慧,郑晓凤,侯丽然,侯 巍,高金波,*

(1.黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室,黑龙江佳木斯 154007;2.佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154007)

山药硒多糖对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

滕 杨1,谷 娜2,罗时旋2,李建慧2,郑晓凤2,侯丽然2,侯 巍1,高金波1,*

(1.黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室,黑龙江佳木斯 154007;2.佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154007)

目的:探究山药硒多糖对CCl4导致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法:采用CCl4诱导小鼠肝损伤模型,测定山药硒多糖对小鼠血清中 ALT、AST、ALP、ALB、γ-GT、TP,组织匀浆中 MDA、GSH水平的影响,并结合病理学HE染色,研究其对小鼠急性肝损伤的保护作用。结果:山药硒多糖高剂量组与模型组相比可显著地降低血清中的ALT、AST、ALB和ALP(p<0.01)以及肝组织中的MDA和GSH(p<0.05)含量,与对照组相比无显著差异,中剂量治疗组血清和肝组织中各种指标与模型组相比有极显著差异(p<0.01),与对照组相比有显著性差异(p<0.05),中、高剂量治疗组均可不同程度地改善CCl4所致的病理组织损伤,且显著优于低剂量组与山药多糖治疗组。结论:山药硒多糖对CCl4所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用,且随浓度增高保护作用加强。

山药硒多糖,四氯化碳,肝损伤,保护作用

山药学名薯蓣(Dioscoreaopposita),为薯科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)植物山药的块茎,即可食用又可药用,如《救荒本草》和《植物名实图考》中所记载[1],药用分布较北,而南方诸省则以食用为主,国家卫生部已将山药列入了第一批药食兼用资源目录[2]。粘液质是山药的主要活性成分之一,其中多糖含量约2.15%～2.96%[3]。硒是人体必需的微量元素,硒多糖作为一种有机硒化合物,兼有硒与多糖二者的活性,具有抗肿瘤[4-6]、抗氧化[7-9]、免疫调节[10-11]、降血糖[12-14]、降血脂等多种生理功能,是一种较好的生物补硒剂。本文在对山药多糖进行硒化的基础上,通过对CCl4引起的小鼠急性肝损伤动物模型血清特异指标检测和肝组织切片HE染色,考察山药硒多糖的保肝作用,为山药的进一步开发利用提供理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级昆明种雄性小鼠70只 哈尔滨医科大学;联苯双酯滴丸 浙江万邦药业股份有限公司;四氯化碳 天津市瑞金特化学品有限公司;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)试剂盒 均购自和光纯药工业株式会社;还原型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、亚硒酸钠、考马斯亮蓝G-250 南京建成生物工程研究所;牛血清蛋白A-9647 Sigma;山药多糖(≥98%)本实验室提取并纯化;其他试剂均为分析纯。

AU2700全自动生化分析仪(1600T/h) 日本OLYMPUS公司生产;FA2004型分析天平 上海恒平科学仪器有限公司;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司;LG10-2.4A型高速离心机 北京京立离心机有限公司;紫外分光光度计 上海第三分析仪器厂;B×41 光学显微镜 OLYMPUS;F6/10型手动匀浆机 上海净信科技;DIR-CHEM5500自动生化分析仪 日本富士公司。

表1 小鼠血清中各种酶及蛋白含量测定结果

注:
注:Δ:p<0.01,与模型组比较,*:p<0.05,与模型组比较;⊙:p<0.01,与对照组比较,◎:p<0.05,与对照组比较,表2同。

1.2 实验方法

1.2.2 动物分组与给药 昆明种雄性小鼠(SPF级)70 只,随机分成7 组(对照组,模型组,阳性组,山药多糖组,山药硒多糖高、中、低剂量组),每组10只,正常饲养一周后,对照组和模型组灌胃等量生理盐水,阳性组灌联苯双脂2 g·kg-1,山药多糖组灌胃给药山药多糖2 g·kg-1,高、中、低剂量组分别灌山药硒多糖4,2,1 g·kg-1,连续灌胃给药7 d;第7 d 给药1 h后,除对照组外,均腹腔注射0.2%的CCl4橄榄油溶液10 mL·kg-1;继续同上喂养7 d,末次给药1 h后,除对照组以外,均腹腔注射0.2%的CCl4橄榄油溶液10 mL·kg-1。

1.2.3 肝损伤指标的检测 参考文献[16]末次给药24 h后,眼球取血,3000 r·min-1离心15 min;分离血清测定ALT、AST、ALP、γ-GT、ALB、TP含量;取小鼠肝脏称重;然后取相同部位肝组织0.2 g用生理盐水漂洗,配置成10%的组织匀浆液,匀浆,离心,取上清液。按试剂盒说明的方法测定肝组织中GSH、MDA的含量。

1.2.4 组织病理学观察 取肝大叶用10%的甲醛固定,按常规方法制备切片,进行HE染色,在光镜下进行病理学检查。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS18.0软件包进行统计分析,多组计量资料分析采用One way ANOVA,多重比较采用LSD,当p<0.01有极显著差异,p<0.05有显著差异。

2 结果与分析

2.1 山药硒多糖的得率与硒含量

按实验1.2.1方法合成10批山药硒多糖,硒多糖的平均得率为36.81%±1.17%,含硒量为 3.42 mg·g-1。

2.2 鼠肝脏指数

肝脏指数是反映肝组织肿胀和炎性浸润的指标,从表1可知,模型组肝脏指数极显著高于正常对照组(p<0.01),说明CCl4导致肝组织肿胀和炎性浸润。不同浓度的山药硒多糖处理组肝脏指数逐渐下降,中、高剂量组较于模型组下降极显著(p<0.01),且与对照组无显著差异(p>0.05),低剂量组、山药多糖组与模型组无极显著差异(p>0.05),与对照组有显著性差异(p<0.01),故山药硒多糖的治疗效果随着浓度的增加有显著的提高且优于山药多糖组。

2.3 血清中各种酶及蛋白含量的测定结果

由表1可知,模型组小鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT水平较对照组明显升高,TP、ALB明显降低,均有极显著性差异;说明造模成功。山药硒多糖高、中剂量组血清ALT、AST、ALP、γ-GT,水平较模型组明显降低(p<0.01),ALB水平明显升高(p<0.01),有极显著差异。表示山药硒多糖对CCl4导致的肝损伤有明显的保护作用,而低剂量组与山药多糖组和模型组相比,无显著差异,与对照组有极显著差异(p<0.01)。可能是因为CCl4进入肝细胞后通过P450酶代谢激活,造成细胞膜的脂质破坏和蛋白变性,肝细胞受损,转氨酶便会释放到血液里,使模型组酶含量升高,血清蛋白含量降低。给予山药硒多糖干预后,由于硒可引起机体的过氧化物酶活力降低[17],有效发挥了硒多糖抗氧化活性,使各治疗组血清中酶和蛋白含量均有改善,且治疗效果随给予剂量的增加而提高。

2.4 对肝组织中GSH、MDA的含量测定结果

由表2可知,模型组与对照组比较,GSH、MDA含量显著升高(p<0.01),表明有严重脂质过氧化损伤。阳性组与模型组比较,GSH、MDA含量显著降低(p<0.05,p<0.01),说明有很好的治疗效果。山药硒多糖中、低剂量治疗组与对照组相比有显著性差异(p<0.05),与模型组无差异;山药硒多糖高剂量组与模型组相比可显著降低肝组织中GSH、MDA水平(p<0.05),表明山药硒多糖较高浓度对CCl4所导致的小鼠肝损伤具有明显的保护作用。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸,其活力大小可以反映机体硒水平,各治疗组给药干预后,提高了机体硒含量,促进GSH-Px酶系催化GSH变为GSSG,使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物,从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害,降低了组织当中的MDA和GSH含量。

表2 小鼠肝组织中MDA和GSH含量

2.5 组织病理学考察

图2显示了山药硒多糖对小鼠肝组织病理变化的影响。由图可知,正常组观察到清晰的细胞,结构正常;模型组、山药多糖组细胞病变严重,CCl4代谢产物抑制细胞膜及线粒体膜上钙泵的活性,导致大量Ca2+内流,使肝细胞变性、坏死,细胞质流出,阳性组未出现大面积坏死的细胞;山药硒多糖低剂量组细胞结构模糊、排列紊乱,多数细胞质流出;中剂量组部分肝细胞出现轻度水肿和脂肪变性;高剂量组细胞结构完整、间隙清晰,明显改善由CCl4造成的肝损伤,且治疗效果随山药洗多糖浓度增加而加强。

图2 肝组织HE染色Fig.2 The results of liver tissue by HE

3 结论

本实验中,模型组的ALT、AST和MDA、GSH明显升高(p<0.01),表明本实验中的CCl4所致急性肝损伤模型成功。山药硒多糖高剂量组可以极显著降低小鼠血清ALT、AST的升高情况(p<0.01),说明其可通过减轻肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润达到抑制肝细胞病变、改善肝损伤的作用。另外,GSH可通过为谷胱甘肽过氧化酶提供还原剂抑制自由基生成以保护肝细胞,山药硒多糖高剂量组能显著降低GSH含量(p<0.05),说明山药硒多糖保护肝损伤的作用机制很有可能与其可以清除自由基有关;病理组织结果显示,山药硒多糖高剂量组可显著改善已损伤的肝组织,修复肝细胞。这些结果表明,山药硒多糖高浓度组有保护小鼠急性肝损伤的作用,其高剂量组的治疗效果与联苯双酯接近。

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Protective effect on liver injury induced by CCl4in mice of Yam selenium polysaccharide

TENG Yang1，GU Na2，LUO Shi-xuan2，LI Jian-hui2,ZHENG Xiao-feng2,HOU Li-ran2,HOU Wei1,GAO Jin-bo1,*

(1.The Key Laboratory of Biological Drugs,Education the Departmenrt of HeiLongJiang Province,Jiamusi 154007,China;2.Jiamusi University,Heilongjiang,Jiamusi 154007,China)

Object:To investigate the protective effect on acute liver injury induced by CCl4in mice of yam selenium polysaccharide. Method:ALT、AST、ALP、γ-GT、ALB、TP levels in serum and GSH、MDA levels in liver tissues were examined. In addition,pathologic changes were examined by HE staining. Results:The ALT,AST,ALP,ALB in serum and MDA,GSH in liver tissue of the high dose group of Yam selenium polysaccharide were lower than the model group and compared with the control group there was no significant difference,and the figure showed that there was significant difference betwen middle dose and modle group,also between middle dose and control group. In the treatment group,middle and high dose could significantly improve the pathological tissue injury ginduced by CCl4,and better than the low dose and the Chinese yam polysaccharide treatment roup. Conclusion:Yam selenium polysaccharide had a protective effect on acute liver injury induced by CCl4and strengthened with the increase its concentration.

Yam selenium polysaccharide;CCl4；acute liver injury;protective effect

2014-10-23

滕杨(1982-),女,在读博士,讲师,主要从事中药活性成分结构修饰及靶向递药系统研究,E-mail:tengyang19820405@163.com。

*通讯作者:高金波(1960-),女,本科,教授，研究方向：生物药体内分析，E-mail:gaojinbo2011@163.com。

佳木斯大学研究生科技创新项目(LZR2014-033)；佳木斯大学青年基金项目(Sq2014-030)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)15-0362-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.068