应用荧光微球检测禽流感病毒的初步研究

杨丽丽+王晓娥+李占东

摘 要：高分子荧光微球是一种性能良好的蛋白质载体，因可连接多种生物活性物质而便于多参数分析等，在生物医学领域被广泛使用。本研究将聚苯乙烯微球作为蛋白质载体，建立一种新的检测禽流感病毒的血清学方法。结果表明，微球与单克隆抗体、抗原、多克隆抗体和荧光二抗形成了双夹心的微球复合物，建立了禽流感病毒定量免疫诊断的基础。

关键词：禽流感病毒；荧光微球；检测

中图分类号：S852.64 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.

禽流感（Avian influenza，AI）是由甲型流感病毒引起的一种人畜共患的传染性疾病综合征。根据致病性的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三级，是危害养殖业的最重要的疾病之一[1]。高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza，HPAI）被世界动物卫生组织列为动物传染病中的A类疫病[2]，在世界范围内具有重要的防疫性和检疫性。禽流感病毒的实验室诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、血清学诊断技术[3-5]、分子生物学诊断技术[6-9]、电镜技术等。新近发展起来的荧光微球因其材料不同而种类很多，由早期的聚苯乙烯微球，到后来出现的多种材料的高分子微球，如聚丙烯酸脂、二氧化硅、聚多糖类、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡啶等类型，其中聚苯乙烯微球目前仍被广泛应用[10-11]。以微球为载体，建立了基于荧光微球的流式细胞术检测方法。荧光微球稳定性好、粒度均一、单分散性好，其球形表面的弧度使抗体结合位点的暴露面与抗原决定簇处于最佳的反应状态，既使发光效率稳定高效又提高了反应的灵敏度，因而在生物医学、食品安全、分析化学以及某些高新技术领域都有着很重要的应用[12-13]。本研究是在高分子荧光微球、免疫荧光技术与流式细胞术等试验原理基础上建立的一种新型免疫学试验方法。

1 材料和方法

1.1 试 剂

红色荧光微球：（Spherotech，Inc）直径为4.0 μm，108个·mL-1；EDC[1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）-碳二亚胺]：购自美国SIGMA公司；NHS（N-羟基琥珀酸亚胺）：购自美国SIGMA公司；禽流感H5亚型单克隆抗体购自扬州大学；禽流感H5亚型基因工程表达抗原购自扬州大学；禽流感病毒多克隆抗体由本研究组自行研制；FITC标记的羊抗小鼠荧光抗体：购自SIGMA公司；FITC标记的羊抗兔荧光抗体：购自SIGMA公司；0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS）：pH=7.4；家兔：购自白求恩医大试验动物中心。

1.2 试验方法

1.2.1 兔抗禽流感抗体的制备及纯化 多克隆抗体制备的免疫方法采用背部多点注射法。选取两只成年公兔，注射禽流感H5亚型灭活疫苗每只1 mL。免疫3次后，测定抗体的效价。当抗体效价达到210以上时，心脏采血分离血清。将血清纯化、浓缩后测定蛋白含量至1 mg·mL-1以上，分装后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 ELISA法确定抗体与抗原的匹配性 应用PBS缓冲液将单克隆抗体稀释成10，5.0，2.5，1.0 μg·mL-1后，于96孔ELISA酶标板纵行包被，放置在4 ℃冰箱过夜，洗涤后加入1%的封闭液BSA，恒温37 ℃封闭1 h，洗涤3次后加入1∶10稀释的禽流感H5亚型表达抗原，放置37 ℃1 h，取出后洗涤。酶标板中加入5 μg·mL-1的兔抗禽流感抗体，放置37 ℃ 1 h，洗涤后加入稀释的酶标羊抗兔IgG二抗，放置37 ℃1 h，洗涤后加入临时配制的底物溶液，显色反应15 min，于反应孔中加入2 mol·L-1硫酸终止反应。450 nm波长下测定OD值。阴性对照同时进行。以此确定单克隆抗体和多克隆抗体与抗原是否匹配。

1.2.3 单克隆抗体的固定 取1 μL直径为4.0 μm羧基荧光微球原液，加入EDC和NHS溶液活化30 min，用pH值7.4的PBS缓冲溶液离心洗涤已活化的微球，加入100 μL禽流感H5亚型单克隆抗体与微球连接，放置摇床于室温振荡2 h。充分离心洗涤后加入含有1%BSA的100 μL PBS溶液，室温振荡2 h后放置在4 ℃冰箱过夜，以此阻断微球表面的未反应位点。

1.2.4 微球双夹心法的流式测定 将连接了单克隆抗体的微球离心洗涤后置于100 μL的PBS溶液中。将一定量的禽流感阳性抗原加入，放置于室温振荡2 h。离心洗涤微球以去除未反应的阳性抗原。再加入一定量的禽流感多克隆抗体，放置于室温振荡2 h。将微球充分离心洗涤使未反应的抗体去除。最后加入一定量的FITC标记的羊抗兔荧光抗体，置摇床室温振荡2 h。离心洗涤3次，去除未反应的羊抗兔荧光抗体。重新将微球放于100 μL的PBS溶液中，然后用流式细胞仪分析测定获得标准曲线。

2 结果与分析

2.1 双夹心ELISA筛选结果

应用双夹心ELISA试验来检测单克隆抗体和多克隆抗体是否匹配的结果见表1。重复3次，设阴性对照。不同浓度的单克隆抗体所测得的OD值在1.5左右，阴性抗原的OD值平均为0.15，以P/N=2.1为临界点，即0.16×2.1=0.315为临界点，测定的OD值大于0.315时即为阳性，如表1结果所示，测定的OD值均为阳性，说明单克隆抗体、抗原、多克隆抗体三者相匹配。

2.2 单克隆抗体连接量的确定

将禽流感单克隆抗体用PBS溶液稀释成不同的浓度后与活化微球连接，洗涤3次后加入FITC标记的羊抗小鼠荧光抗体与之反应，通过流式细胞仪检测的荧光信号强度确定单克隆抗体的最佳工作浓度。当FITC绿色荧光信号与微球的红色荧光信号被同时检测出，即达到了“双阳性”时，说明微球与抗体已连接。已连接抗体的微球与微球总数的比值用连接率表示。结果如表2所示，当单克隆抗体连接浓度为300 μg·mL-1时，平均连接率达到 87.6%，因此确定300 μg·mL-1为单克隆抗体的最佳反应浓度。

2.3 多克隆抗体最佳反应浓度的确定

将活化的荧光微球与最佳浓度单克隆抗体连接后加入1%的BSA进行封闭，然后加入过量的抗原与其连接，最后加入不同浓度的多克隆抗体及一定量的FITC标记的羊抗兔荧光抗体。应用流式细胞仪检测反应体系，当微球的红色荧光信号与荧光抗体的FITC绿色荧光信号被同时检测到，即达到了“双阳性”时就可确定多克隆抗体最佳浓度及与微球的连接率。试验结果表明，当多克隆抗体的浓度为150 μg·mL-1时，平均连接率达到 87.5%，如图1所示。

3 结论与讨论

3.1 单克隆抗体与荧光微球的连接

微球表面连接的单克隆抗体数量的多少与最终检测信号强度的高低有直接关系。但是当单克隆抗体在微球表面饱和时，连接率不会随着单克隆抗体浓度的增加而有所提高。同时应用未活化的微球与一定量的荧光抗体进行反应，检测荧光抗体与荧光微球的非特异性结合能力，试验结果表明未活化微球与荧光抗体之间无非特异性结合。由此看来，此方法可以避免非特异性反应，优于传统的ELISA 方法。

3.2 连接方式比ELISA方法更稳定

微球与单克隆抗体的连接不同于传统的ELISA方法，ELISA方法是通过单克隆抗体与聚苯乙烯本物理结合（非特异性吸附），疏水连接的。而基于微球的流式细胞检测方法是通过共价键与微球结合的，非常稳定。

3.3 数据的读取与重复性

在传统ELISA方法的重复过程中有很大的变化，并且不同孔之间也有很大的变化。它是一种间接和动态的方式，在酶的扩大效应下以颜色的变化量来读取数据，在扩大效应中容易出现错误。流式细胞术分析方法的特点是它与传统的ELISA方法相比更加准确和敏感。用流式细胞仪检测时，使单个微球逐个通过激光器，读取的是荧光数据，数据结果更加直接、敏感、稳定。

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