消肿方对骨关节炎家兔软骨细胞凋亡及同源细胞群数量的影响*

李 亮，刘安平，周正新，周章武，江树连，盛炎炎

（安徽中医药大学第一附属医院骨伤科，安徽 合肥230031）

有研究表明，软骨细胞凋亡是骨关节炎（Osteoarthritis，OA）关节软骨退变的关键因素之一[1]，软骨细胞过度凋亡，数量过少，引起细胞外内环境稳态的改变，又使软骨细胞的凋亡增加，形成恶性循环，从而导致OA 的发生[2]，消肿方是根据我院骨伤科国家级名老中医丁锷教授根据“补肾活血利水”法组成的中药复方，以补肾活血利水为主，临床用于治疗OA，多年的临床观察结果显示其有较理想的治疗效果[3]。前期研究显示：补肾活血利水法具有促进软骨细胞增殖、抑制其凋亡、调控滑膜组织基因表达谱及多种细胞信号通路等多种作用[4]，为了进一步探讨其疗效机制，揭示其发挥疗效的药理作用特点或靶点，本研究通过建立兔OA 动物模型，观察不同浓度消肿方对动物模型的软骨细胞凋亡及同源细胞群数量的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6 月龄体重2.6～3.2kg 的新西兰大耳白兔36只，雌雄各半，随机分为6 组（模型组、空白组、阳性对照组，中药消肿方低剂量组（40g/kg）、中剂量组（80g/kg）、高剂量组（160g/kg），每组6 只，实验动物均购自安徽中医药大学动物实验中心，普通级，实验动物许可证号：SYXK（皖）2013-0126。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

Bcl-2、Bax 免疫组化试剂盒和软骨细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德公司）。

1.2.2 主要仪器

37℃温箱（上海三发科学仪器有限公司 型号：GNP-9160 型），干燥箱（上海精宏实验设备有限公司 型号：DHG-9140 型），石蜡切片机（Leica2135），BM-Ⅱ型病理组织包埋机（安徽省电子科学研究所），ZT-RP 生物组织脱水机、QP 切片漂烘温控仪（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司），88-1大功率磁力搅拌器、QT-1 漩涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司），LX-100 手掌型离心机（上海市麒麟医用仪器厂），Nikon80 荧光显微镜（新飞达光学仪器公司）。

1.3 实验药物

消肿方剂生药饮片由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供（怀牛膝15g，茯苓皮20g，黄芪15g，当归10g，莪术8g，萆薢10g，红花2g 组成），将生药饮片80g 加入920g 水中制备成中剂量组，低、高剂量组分别将生药饮片40g，160g 加入960、840g水中制备成低、高剂量组；盐酸氨基葡萄糖规格：0.24g*28 片/盒，四川新斯顿药业生产，产品批号为：141004。

1.4 实验方法

1.4.1 造模

除空白组外，所有动物采用改良Hulth 法[5]制作膝关节OA 动物模型，麻醉生效后，常规消毒、铺巾，取兔膝关节前内侧髌旁入路，切开皮肤及皮下组织后，内侧支持带及关节囊后，将髌骨向外侧脱位，显露膝关节腔，显露内侧半月板及前交叉韧带，依次切除内侧半月板，切断内侧副韧带，切断前交叉韧带（改良Hulth 法），再逐层关闭关节囊、皮下组织、皮肤，敷料包扎切口，不予外固定，建模后连续4d青霉素3×104U 肌肉注射，10d 后开始每天强迫兔活动40min，连续6 周。

1.4.2 实验分组与给药

随机分为6 组后，根据人与兔体表面积比值，人与兔药物剂量比值为1/3，分别对消肿方低剂量组、中剂量组、高剂量组采用40、80g/kg 以及160g/kg 的消肿方煎剂20mL 灌胃，空白组灌服等容积生理盐水，阳性对照组灌服溶有6 片硫酸氨基葡萄糖的生理盐水溶液（1d 分3 次），连续治疗4 周。

1.4.3 检测指标和检测方法

1.4.3.1 组织形态学检查

光镜下观察软骨细胞、软骨陷窝、软骨囊、同源细胞群及软骨细胞间质形态、结构和数量的变化，在10×40 光镜视野下观察，任选5 个视野观察，每个视野计数同源细胞群数量。

1.4.3.2 细胞凋亡检测

采用TUNEL 法（原位缺口末端标记法）在10×40 光镜视野下观察，任选5 个视野观察，平均计数100 个软骨细胞中细胞核染色成棕色颗粒的细胞数目即为凋亡指数（AI）。

1.4.3.3 免疫组化检测

标本石蜡切片，免疫组织化学染色（三步法）：石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS（磷酸盐缓冲液）浸泡5min×2 次，5%～10%正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h 或4℃过夜。PBS 冲洗，5min×3 次。滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10～30min。PBS 冲洗，5min×3 次。滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min。PBS 冲洗，5min×3 次。显色剂显色DAB（磷酸缓冲液）3～15min 自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。在光镜下观察Bcl-2 蛋白阳性表达为浆黄色颗粒，试验以己知阳性染色切片作为阳性阳性对照，以磷酸缓冲液代替第一抗体作为阴性阳性对照，在400 倍放大率下，任选5 个高倍镜视野，计算Bcl-2 阳性细胞所占百分比。

1.5 统计方法

所有数据应用SPSS 17.0 软件包进行统计学分析，参数值用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔膝关节软骨细胞形态学观察（HE 染色，10×40 倍）

图1 空白组

图2 模型组

图3 阳性对照组

图4 治疗组（低剂量组）

图5 治疗组（中剂量组）

图6 治疗组（高剂量组）

由图1-6 可知，空白组：软骨细胞结构清晰、排列规则，软骨陷窝及软骨同源细胞群数量多，软骨细胞间质少，模型组：软骨细胞形态不规则、排列杂乱，软骨陷窝及软骨同源细胞群数量很少；软骨细胞间质很多，治疗组：软骨细胞结构较清晰、排列较规则，软骨陷窝及软骨同源细胞群数量少，软骨细胞间质多，介于空白组和模型组之间。

2.2 软骨同源细胞群数量比较

由表1 统计结果显示：同一时间段，在不同组别两两比较，高剂量治疗组与中剂量治疗组相比较时，P>0.05，4 周时阳性对照组与模型组比较时，P>0.05，8 周及12 周时中剂量治疗组与低剂量治疗组相比较时，P>0.05，其他组别两两比较时，P＜0.05。统计结果表明：模型组软骨同源细胞群数量降低，治疗后，软骨同源细胞群数量升高，在治疗早期（4周），随中药剂量由低剂量组到中剂量组增加时，其升高幅度加大，有统计学意义，但经过治疗8 周及12 周后，随中药剂量增加时，虽升高幅度加大，无统计学意义。

在各组随时间变化（4 周，8 周，12 周）两两比较后统计结果为：空白组（P＜0.05），模型组（P＜0.05），阳性对照组（P＜0.01），治疗组（低剂量组）（P＜0.01），治疗组（中剂量组）（P＜0.05），治疗组（高剂量组）为0.058，0.003，0.005，实验结果表明：除高剂量治疗组由4 周延长至8 周时，软骨同源细胞群数量增加不明显外，其余各组实验动物随时间延长，出现软骨同源细胞群数量增加，有统计学意义。

2.3 采用TUNEL 法检测软骨细胞凋亡指数

由表2 可知，在同一时间软骨细胞凋亡指数随不同组别变化两两比较后统计结果为：4 周、8 周、12 周时P＜0.05。实验结果表明：模型组软骨细胞凋亡指数明显升高，而经过中药消肿方治疗后，软骨细胞凋亡指数下降，而且随中药剂量增大，其下降幅度加大，有统计学意义。

在各组随时间变化（4 周，8 周，12 周）两两比较软骨细胞凋亡指数后统计结果为：空白组8 周与4周相比，P=0.175，12 周与8 周相比，P=0.025＜0.05，模型组和阳性对照组8 周与4 周相比，P=0.025＜0.05，12 周与8 周相比，P=0.695，在低、中、高剂量治疗组8 周与4 周相比，12 周与8 周相比，P＜0.05。实验结果表明：空白组软骨细胞凋亡指数在12 周时明显升高，模型组和阳性对照组软骨细胞凋亡指数在8 周时明显升高，超过8 周后，升高不明显，治疗后，软骨细胞凋亡指数下降，在各剂量治疗组，随治疗时间由4 周逐渐延长至8 周、12 周时，其下降幅度加大，有统计学意义。（见图7-12）

表2 软骨细胞凋亡指数

图7 空白组

图8 模型组

图9 阳性对照组

图10 低剂量治疗组

图11 中剂量治疗组

图12 高剂量治疗组

2.4 BCL-2 阳性细胞百分比

由表3 可知，在同一时间软骨细胞BCL-2 阳性细胞百分比随组别变化两两比较后统计结果为：4周、8 周、12 周时P＜0.05。实验结果表明：模型组BCL-2 阳性细胞百分比最低，随组别变化至阳性对照组、低、中、高剂量治疗组时，软骨细胞BCL-2 阳性细胞百分比逐渐升高，而且随中药剂量增大，其升高幅度加大，有统计学意义。

在各组随时间变化（4 周，8 周，12 周）两两比较后统计结果为：空白组12 周与8 周相比，P＜0.05，其余5 组8 周与4 周相比，12 周与8 周相比，P＜0.05。实验结果表明：随时间延长，各组实验动物均出现BCL-2 阳性细胞百分比明显升高，有统计学意义。（见图13-18）

表3 BCL-2 阳性细胞百分比

图13 空白组

图14 模型组

图15 阳性对照组

图16 低剂量治疗组

图17 中剂量治疗组

图18 高剂量治疗组

3 讨论

OA 发病率高，是老年人的最常见的慢性关节疾病，尤以膝关节OA（KOA）常见。北京市区的调查结果显示60 岁以上老年人膝关节X 线OA 患病率女性为42.8%，男性为21.5%；临床KOA 患病率女性为15%，男性为5.6%[6]。

OA 指由多种因素引起关节软骨纤维化、皲裂、溃疡、脱失而导致的关节疾病。目前病因尚不明确，其发生与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传因素等有关。其病理特点为软骨蛋白多糖含量减少，导致软骨破坏，进而全层软骨消失，深达骨质，关节边缘骨赘形成，软骨下骨增厚、囊性变、硬化，滑膜呈慢性炎症改变，同时滑膜释放细胞因子，进一步破坏软骨[7]，其病变涉及整个滑液关节，包括软骨、滑膜和软骨下骨、其发病过程最主要的特点是以膝关节软骨的退行性改变和继发性骨质增生为主要病理改变，表现为关节间隙变窄，软骨下骨硬化[8]，OA 的发病机制尚不完全清楚，研究表明细胞外基质的降解、软骨细胞凋亡等是该病发生的重要因素。

同源细胞群是由一个软骨细胞分裂增殖形成的软骨细胞群，位于软骨组织的中部。每个同源细胞群有2～8 个软骨细胞，包含在一个大的软骨陷窝内，后者又分成几个小的陷窝，各含一个软骨细胞。软骨的同源细胞群深层的软骨组织内软骨陷窝较少，但形态较大，内含多个软骨细胞，但细胞较成熟，代谢缓慢，越靠近软骨的中部，同源细胞群的数目越多，反映了软骨细胞外基质的生长，同源细胞群的数目下降，则表明细胞外基质的降解，目前对于同源细胞群数目的相关研究较少，因此关于这方面的研究有待进一步开展。

软骨细胞凋亡在OA 病理过程中发挥的作用越来越受到重视[9]，细胞凋亡（细胞程序性死亡）是一个主动的、信号依赖的过程，并由基因控制的主动的、高度有序的死亡过程。线粒体凋亡、内质网应激性凋亡、细胞自噬在OA 的发病过程中发挥重要的调控作用[10]。因此关于软骨细胞凋亡的实验研究成为目前的热点之一。目前有研究表明Bcl-2 家族是调节细胞凋亡相关蛋白中的关键调因子，其抗凋亡与促凋亡成员协调作用[11]，Bcl-2 家族蛋白的一个显著特征是具有Bcl-2 同源结构域，主要体现在4个保守的区域，即BH1、BH2、BH3、BH4 结构域，典型的抗凋亡成员如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-W 等含有4 个短的保守的BH 结构域和一个C 端疏水尾状结构，即跨膜结构域，这类成员具有抗凋亡活性，在免疫调节中发挥重要作用。

KOA 属中医“痹证”范畴，是临床难治性疾病之一，晚期致残率高，多数患者最终需要人工关节置换以改善功能，所以本病治疗的关键在于早期防治[12]，从西医来说，即使仅以缓解症状、改善功能为目的，也缺少疗效更好、不良反应更少的治疗方法，因此中医药治疗骨关节炎已经逐渐受到重视。中医对其认识历史悠久，治疗手段多样，有临床效果好、副作用少等优势[13]。中医认为中老年膝骨关节炎的主要病机是肝肾不足，气虚血瘀，虚损与瘀实并存，虚损为本，成其病，瘀实为标，其病在筋骨，与肝肾密切相关[14]，消肿方是根据我院骨伤科国家级名老中医丁锷教授根据“补肾活血利水”法组成的中药复方，有补肾利水、活血化瘀之功，对痰、瘀、水互阻所致的骨关节炎能起较好的治疗作用[15]。

氨基葡萄糖是构成关节软骨的内源性物质，可刺激黏多糖的生化合成及增加骨骼钙质的摄取，以提高骨与软骨组织的代谢功能和营养，同时改善与增强滑膜液的黏稠度，增加滑膜液合成，提供关节润滑功能，还可阻断OA 的病理过程，防止疾病进展，抑制和消退关节变性形成，从而有效修复软骨关节，持久缓解疼痛，阻止疾病进展，具有优越的耐受性和安全性，临床广泛用于骨关节炎的治疗，是第一个经临床证明的骨关节炎疾病改善药物[16]，因此在本研究中作为阳性对照药物。

在制作模型方法上，本研究采用经典的改良Hulth 法建立骨关节炎家兔模型，通过切除内侧半月板，切断前交叉韧带、内侧副韧带造成膝关节的不稳，使关节软骨承受了异常的机械压力，从而导致软骨退变及破损[17]，并且采取强迫活动方式诱导模型建立。兔膝骨关节炎模型中关节内手术方法，如改良Hulth 法等模型诱导成功率高，稳定性好，应用广泛，特别适用于膝关节内注药预防和减轻OA病理改变的研究[18]。

本实验研究表明：空白组软骨细胞凋亡指数在12 周时明显升高，模型组和阳性对照组软骨细胞凋亡指数在8 周时明显升高，超过8 周后，升高不明显，而经过中药消肿方治疗后，软骨细胞凋亡指数下降，其下降幅度与治疗时间以及中药剂量有相关性，消肿方具有抑制软骨细胞凋亡作用；模型组软骨同源细胞群数量降低，在治疗早期（4 周），随中药剂量由低剂量组到中剂量组增加时，其升高幅度加大，有统计学意义，但经过治疗8 周及12 周后，随中药剂量增加时，虽升高幅度加大，无统计学意义，除高剂量治疗组由4 周延长至8 周时，软骨同源细胞群数量增加不明显外，其余各组实验动物随时间延长，出现软骨同源细胞群数量增加，有统计学意义，表明消肿方能增加软骨同源细胞群数量，并与治疗时间以及中药剂量有相关性；模型组BCL-2 阳性细胞百分比最低，通过消肿方治疗后，软骨细胞BCL-2 阳性细胞百分比逐渐升高，表明消肿方能升高BCL-2 阳性细胞百分比，并且其升高幅度与治疗时间以及中药剂量有相关性；但其抑制软骨细胞凋亡与升高同源细胞群数量及BCL-2 阳性细胞百分比内在关系以及是否通过某些信号通路发挥其干预作用，尚有待进一步研究证实。

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