水貂嗜水气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

秦绪伟 （齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

试验研究

水貂嗜水气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

秦绪伟 （齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

本试验从发病水貂分离到一株细菌，经生化试验、16srRNA基因序列测定最终确定为嗜水气单胞菌，经动物试验确定有致病性，经药敏试验选择氧氟沙星作为理想的药物，最终取得良好的治疗效果。

水貂、嗜水气单胞菌、分离、药敏试验、鉴定

山东临沂某特种动物养殖场水貂发生以口鼻出血、急性死亡为主要临床症状的病例，养殖户已经免疫过出血性肺炎疫苗，按照出血性肺炎使用药物治疗效果不佳，来实验室检测。水貂气单胞菌病又称为水貂出血性败血症，嗜水气单胞菌隶属于弧菌科气单胞菌属，在气单胞菌属中最为常见，广泛存在于淡水、污水和土壤［1］，有些菌株对人和动物都有较强的致病性，有些菌株是环境和动物正常菌群的组成部分［2］。该养殖户养殖水貂约3000只，新进一批淡水鱼，饲喂5d后开始发病，开始每天死亡1～2只，发病7d时每天死亡约80只，主要表现为吃食多、营养状况良好的死亡较多，急性死亡、口鼻出血，来不及治疗。解剖可见口鼻出血、血凝不良、肝脏金黄色、肺脏严重出血、脾脏淤血、胃黏膜脱落、肾脏质地较硬有出血点。经化验确诊为水貂患致病性嗜水气单胞菌。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株 来自于山东临沂一水貂养殖场水貂病料尸体。解剖后从肝脏、肺脏、心血分离一株细菌。

1.1.2其他材料 营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、气单胞菌琼脂培养基等购自青岛海博生物技术有限公司；微量生化试剂管购自北京路桥技术有限责任公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司；PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司；其他实验室常规试剂。

1.2方法

1.2.1细菌的分离培养［3］对发病水貂进行解剖，无菌条件下取肝脏、肺脏、心血分菌，接种于血清营养琼脂，在37℃恒温培养箱培养24h，培养出的细菌挑取单个菌落进行纯化，同时接种麦康凯琼脂、SS琼脂、兔血营养琼脂、气单胞菌鉴别琼脂、马丁肉汤，观察菌落生长情况和菌落形态。

1.2.2细菌的16S rRNA分子生物学鉴定 无菌挑取平板

上的菌落加入到1ml无菌水中，震荡混匀后沸水浴7min，冰浴5min，离心上清作为基因扩增的模板，设计引物：F1-5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，R1-5'ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3'，PCR反应体系（50μl）：10*PCR Buffer（含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/ L）5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，引物（20umol/L）各1μl，模板2μl，ddH2O36.8μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 10min。取PCR产物5μl用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送交上海基因测序公司进行测序，将测序结果提交Genbank进行比对，构建系统发育树，判定细菌的系统发育地位，以97%相似性为界限判定为何种菌。

1.2.3细菌的生化试验［4］血清平板上挑取单个菌落，接种于马丁肉汤培养基培养，在37℃恒温培养箱培养24h，分别取0.2ml接种于乳糖、葡萄糖、水杨苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇等微量生化反应试管，24h后观察生化反应结果。

1.2.4细菌的药敏试验 使用药敏纸片法对分离的细菌进行药敏试验，用接种环挑取单个菌落涂布于血清营养琼脂平板，将药敏片贴于平板，37℃恒温箱培养24h后量取药敏片抑菌圈的直径，判定该菌的耐药性。

1.2.5细菌的毒力试验 在营养琼脂平板无菌取单个菌落，接种于马丁肉汤培养基，37℃恒温摇床培养箱培养24h，培养后计数，将细菌原液10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液分别腹腔注射18～22g小白鼠5只，0.5ml/只，注射后观察7d，对照组3只。对死亡的小白鼠解剖进行细菌分离。将分离细菌取最大稀释度再进行动物回归试验。

2　结果与分析

2.1细菌培养结果

无菌分离病死水貂的心血、肝脏、肺脏，血清平板上37℃温箱24h培养可见中等大小圆形、稍微隆起、光滑湿润、半透明、灰白色菌落；挑取血清平板上单个菌落，转接后在麦康凯琼脂上37℃温箱24h培养可见中等大小无色圆形、光滑、隆起的菌落；SS琼脂上37℃温箱24h培养可见中等大小无色圆形、光滑、隆起的菌落；血琼脂平板上37℃温箱24h培养可见中等大小无色圆形、光滑、隆起的菌落，有明显的β溶血环；气单胞菌鉴别琼脂培养基平板上37℃温箱24h培养可见中等大小圆形、光滑、隆起的红色菌落；马丁肉汤震荡培养24h可见液体混浊，图片镜检可见革兰氏染色阴性，两端钝圆杆菌，形态较小，有荚膜无芽孢。

2.2细菌16S rRNA的分子生物学鉴定结果

根据上海测序公司返回的测序结果，采用Bioedit软件参照正反向序列图谱对序列进行人工校对，然后输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较，最后构建系统发育树，与气单胞菌相似性为99.7%，确定为气单胞菌。

2.3细菌的生化结果

将分离菌进行了微量生化试验，试验结果表明该菌能发酵蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖，氧化酶试验阳性，不发酵乳糖、鼠李糖、肌醇和山梨醇，硝酸盐还原试验、七叶苷、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶试验阳性，鸟氨酸脱羧酶试验阴性，确定为嗜水气单胞菌，结果见表1。

表1　分离菌生化鉴定结果

2.4细菌的药敏试验结果

将嗜水气单胞菌涂布于血清营养琼脂平板，把标记好的药敏片贴于血清平板，最终根据抑菌圈的大小判定药物的敏感程度，其中头孢喹肟、头孢噻肟、头孢噻呋钠高敏敏感，左氧氟沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星中度敏感，强力霉素、阿奇霉素、粘杆菌素、氟苯尼考低度敏感，阿莫西林、氨苄西林、壮观霉素、替米考星不敏感，最终选择左氧氟沙星作为敏感药物拌料、头孢喹肟注射作为治疗。药敏结果见表2。

表2　分离菌的药敏结果 （mm）

2.5毒力试验结果

从血清琼脂平板无菌挑取单个菌落接种于马丁肉汤培养基，37℃恒温培养24h后进行细菌计数，计数为40亿/ml，将细菌原液10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液分别腹腔注射小白鼠5只，0.5ml/只，注射原液10倍稀释液、100倍稀释液组第2天全部死亡，1000倍稀释液观察7d未见死亡，可见2000万细菌对小白鼠较强毒力，200万细菌对小白鼠无毒力，分离菌属于中强毒。对死亡小白鼠解剖，心血、肝脏细菌分离，血清平板分离到中等大小圆形、隆起、光滑湿润、半透明、灰白色较纯的菌落，经鉴定为分离的嗜水气单胞菌，将分离菌接种于马丁肉汤培养基，37℃恒温培养24h后100倍稀释，将稀释液腹腔注射小白鼠5只，0.5ml/只，第2天全部死亡，对照组观察7d，健活。

3　讨论

3.1水貂嗜水气单胞菌的分离与鉴定

该病例发生在9月中旬，正值天气炎热，水貂换毛期间，水貂机体抵抗力较弱，死亡主要为营养状况良好体况较胖的水貂。主要症状为急性死亡、口鼻出血，少量减食拒食尖叫痉挛后死亡。畜主在7月份已经免疫过出血性肺炎疫苗，按照水貂出血性肺炎投药治疗，采取全群空气环境消毒，投服抗生素治疗7天效果不佳，死亡增加。来本处解剖可见口鼻出血，血凝不良，气管环内有血液，肺脏严重出血淤血呈黑色肿胀，肝脏肿大呈现严重的土黄色、质脆易碎、有出血点，脾脏肿大淤血呈现大量黑色淤血斑，肠系膜淋巴结肿大灰白色坏死，胃内大量食物，胃黏膜脱落。临床解剖症状与绿脓杆菌引起的出血性肺炎相似，经实验室分离鉴定为嗜水气单胞菌。

3.2水貂嗜水气单胞菌的鉴别诊断

此次水貂发病初期养殖户自行诊断为绿脓杆菌感染引起的水貂出血性肺炎，采取环境消毒与抗生素治疗效果不佳，经调查养殖户两月前注射过肺炎二价疫苗。水貂嗜水气单胞菌和绿脓杆菌引起的肺炎临床上都是急性死亡、口鼻出血，解剖都是肺脏严重出血，临床通过临床症状和解剖症状很难与绿脓杆菌引起的出血性肺炎区别，养殖户注射过绿脓杆菌二价疫苗，通过环境消毒和使用治疗绿脓杆菌的抗生素无效，可以初步排除绿脓杆菌病，确诊需要细菌分离鉴定，通过细菌分离，分离菌进行绿脓杆菌PCR阴性，进行分离菌16S rRNA分子生物学基因测序确定为气单胞菌，根据一系列生化试验确定为嗜水气单胞菌。

3.3水貂嗜水气单胞菌病的诊疗

停止使用淡水鱼，改用新鲜的海杂鱼，清洗水罐，饮水投聚维酮碘消毒，根据药敏试验选择氧氟沙星拌料，15mg/只，使用后3d见效，发病死亡减少，5d后控制疫情，不吃食的注射头孢喹肟，2mg/kg体重肌肉注射，另外添加黄芪多糖、紫锥菊、电解多维等添加剂提高免疫力，按照疗程治疗取得良好的效果。水貂的嗜水气单胞菌报道的比较少，临床发病症状、解剖症状与绿脓杆菌、巴氏杆菌等引起的出血性肺炎相似，一般不作为发病诊断致病的主因，在临床上也不容易确诊，一般发现急性死亡口鼻出血首先怀疑是巴氏杆菌或者绿脓杆菌，养殖户按照绿脓杆菌选择敏感的药物和环境消毒效果不佳，养殖户也注射过绿脓杆菌二价疫苗，通过试验最终确诊为水貂患嗜水气单胞菌病，根据其新购进海杂鱼使用5d并从其中分离到嗜水气单胞菌确定是由使用饲料鱼引起的水貂嗜水气单胞菌病，采取更换饲料鱼、抗生素治疗的方案，很好地制止了死亡，减少了损失。

3.4水貂嗜水气单胞菌病的预防

本病没有疫苗免疫，预防本病主要是做好基本卫生防疫工作外，主要是防止饲料鱼的感染，不使用变质鱼，久存的鱼及时清理。嗜水气单胞菌主要来源于鱼类，此次水貂发病就是因为使用了来源不明的饲料鱼，使用5d后开始发病，预防本病主要是禁止使用来源不明的、有异味的变质饲料鱼。一旦发生出血性肺炎按照绿脓杆菌治疗无效或已经注射过绿脓杆菌疫苗，可以考虑是嗜水气单胞菌。若诊断为嗜水气单胞菌果断采取更换饲料，使用敏感抗生素治疗。

［1］ 陆承平. 兽医微生物学［M］. 第5版. 北京： 中国农业出版社， 2013，123-127.

［2］ 钱爱东. 兽医全攻略毛皮动物疾病［M］. 北京： 中国农业出版社，2009， 297-300.

［3］ 周庭银. 临床微生物学诊断与图解［M］. 第2版. 上海： 上海科学技术出版社. 2007， 193-195.

［4］ 东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京： 北京科学出版社， 2001， 17-119.

S852.61

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1007-1733（2015）06-0001-03