外周血染色体制备方法的探讨

庄建龙，王元白，庄倩梅

（泉州市妇幼保健院·儿童医院产前诊断中心，福建泉州362000）

染色体核型分析对人类遗传病的研究和诊断有着非常重要的意义［1］，而其中染色体G 显带长度是诊断染色体结构异常的关键［2］。秋水仙素使处于增殖周期中的分裂细胞停止在中期。秋水仙素的加入量和加入时间成为获得中期有丝分裂细胞的关键［3］。通过改变秋水仙素处理时间及用量等几个关键步骤，成功地改良了外周血染色体的质量，不仅在染色体长度、分散度及带型上得到了很大程度的改善，而且也大大地缩短了制备时间，节省了人力资源。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2014年7月于本院进行了产前诊断中染色体检查的1 170例患者。

1.2 仪器与试剂 细胞培养箱为美国SHEL LAB产品，淋巴细胞培养液6mL为青岛莱佛生物工程研究所产品，秋水仙素100μg／μL，胰酶为美国Gibco公司产品，0.075mol／L 氯化钾低渗液，新鲜配制的固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1），pH7.4和pH6.8磷酸盐缓冲液，吉姆萨染液购自青岛莱佛生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 接种 用肝素湿润注射器无菌操作抽取2 mL 静脉血，取外周血淋巴细胞培养液溶解，碘伏消毒培养瓶盖后，在酒精灯火焰旁加入0.5mL血标本（与本室常规制备一致）。

1.3.2 培养 将接种后标本置37 ℃培养箱中培养68～72h（与本室常规制备一致）。

1.3.3 收获 收获前15 min加入100μg／μL 秋水仙素50 μL，将培养的细胞移入10 mL 刻度离心管中，2 000r／min离心10min（本室常规操作为收获细胞前1h加入100μg／μL秋水仙素17μL，2 000r／min离心10min。

1.3.4 低渗 离心l0min弃上清液后加入8mL 0.075mol／L的KCl低渗液，吹打均匀后置于37℃水浴箱15min，取出离心管加入新鲜配制的固定液（甲醇∶乙酸＝3∶1）0.5mL［4］预固定10min，以2 000r／min离心10min（本室常规操作为低渗30min，加入2mL固定液预固定，2 000r／min离心10min）。

1.3.5 固定 离心后弃去上清，加入新鲜配制的固定液（甲醇∶乙酸＝3∶1）8mL，混匀后室温放置30min，2 000r／min离心10min后，重复以上步骤进行再固定。最后根据沉淀量多少制备出浓度大致一致的混悬液（0.5～1mL），本室常规操作为2 000r／min离心10min。

1.3.6 推片 吸取2～4滴细胞悬液滴于洁净载玻片上，每人制2～3片，吸取30μL左右悬液吹散，酒精灯过火后将制备的染色体标本片置鼓风干燥箱内70℃3h进行老化，取出后自然冷却至室温（本室常规操作为60 ℃3h）。染色显带方法参考《人类染色体方法学手册》［5］。

1.4 分散效果判断 在20个计数分裂相中计数：（1）不合格标本判断标准为染色体相互缠绕或重叠小于等于2条的核型小于或等于50%（10／20）；（2）合格标本的判断标准为染色体相互缠绕或重叠小于等于2 条的核型为50%～75%［（10～15）／20］；（3）最佳标本的判断标准为染色体相互缠绕或重叠小于等于2条的核型大于或等于75%（15／20）。

1.5 带型效果判断 在20个计数分裂相中，不合格标本：染色体长度较短，染色体带纹不清，但可以辨认出2 号、4 号、6号、13号、17号、20号及22 号染色体特征性带型；合格标本：可以清楚地辨认2号、4号、6号、13号、17号、20号及22号染色体特征性带纹，其中染色体可分析且长度较理想的核型5%～25%［（1～5）／20］；最佳标本：在合格标本上，染色体可分析且长度理想的核型大于或等于25%（5／20）。

1.6 统计学处理 随机抽取改良前和改良后标本各200份，进行分散效果和带型效果判断，用SPSS18.0软件进行统计分析，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

与本室常规处理（图1A、1B）相比，改良后的外周血染色体分散度好，分裂相多，长度更长，带型清晰，染色稳定易于控制，非常适合批量处理（见图1C、1D）。改良后染色体长度更长，分散度更好，显示带型增多，更有利发现异常染色体，减少了漏诊率，值得推广应用。经过统计学分析，改良后与改良前的分散度及带型的合格率与最佳率差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、2。

图1 改良前后的染色体带型图

表1 改良前后染色体分散效果比较

表2 改良前后染色体显带效果比较

3 讨 论

通过对秋水仙素，低渗，预固定和固定等步骤的改良，制备出的染色体标本相比本室常规制备的染色体标本不仅有更好分散度，染色体长度更长，带型显示更多，而且制备更稳定。

首先，秋水仙素为细胞培养中使用的纺锤体阻断剂，它使正在分裂的细胞停留在分裂中期，以获得大量中期分裂相供分析研究所用。在血细胞培养时，秋水仙素加入的剂量、浓度及处理时间与中期分裂相的多少和染色体长短有密切的关系［6－7］。秋水仙素加入量过多，染色体太短，加入量太少，染色体瘦长或很少中期分裂相。因此，加入较高浓度短时间的处理，将本室常规制备时秋水仙素的终浓度由0.28μg／μL，调整至0.83μg／μL，处理时间由1h缩短至15min，不仅提高了效率，而且获得了较多的分裂相，更长的染色体，显示更多带型，有利于异常染色体的检出。有文献报道加入100μg／μL 秋水仙素100μL［6］，笔者认为其染色体长度及带型未达到最佳，可能是秋水仙素用量过多导致染色体收缩。改良后的染色体制备方法，加入50μL 秋水仙素，能够得到满意的染色体长度及带型。

其次，低渗技术是染色体培养中的光键环节，低渗时间长短关系到分散的好坏。处理时间多长，将导致细胞膜过早破裂，造成分裂中期细胞丢失；处理时间过短，细胞膨胀不足，则染色体分散不佳。低渗处理适当，所得染色体分散度好，轮廓清楚，可染色强，在显带染色时能很好地显示带型特征［8］。因此，笔者将本室常规制备低渗时间30min改良为15min，获得染色体的分散度好，可染色性强，带型显示稳定，同时也提高了工作效率。

再次，预固定也是染色体制备的一个重要影响因素，桂俊豪等［9］的研究表明，当预固定液剂量占总体积的1.25%、2.50%或3.75%时，染色体分散质量较好，可用核型多；预固定液比例大于或等于6.25%可导致细胞间相互粘连，且染色体间相互积聚的倾向更为明显。因此，笔者将原来的预固定液剂量由2mL改良为500μL，约占总体积的3.75%，处理后发现较少的预固定液能够获得更加干净的沉淀和良好的分散度，经过统计学分析表明，改良后染色体的分散度与改良前有明显差异。

固定应彻底，吹打不要太用力，以免细胞破裂，染色体丢失。若固定不彻底，染色体分散不佳，可重复固定或延长固定时间。

最后，经过大量的实践证明，改良后的方法在各个方面都优于常规操作方法。该法不仅在染色体的质量上有了大大的提升，而且提高了工作效率，值得广泛的推广。

［1］周焕庚，夏家辉，张思仲.人类染色体［M］.北京：科学出版社，1987：48－63.

［2］张凤芹，丁红炜，石庆芳，等.关于外周血染色体制备方法的改进［J］.中国误诊学杂志，2008，8（5）：1198.

［3］陈秀云.外周血染色体制作方法改进［J］.现代预防医学，2006，33（5）：796－799.

［4］斯佩克特，戈德曼，莱因万德.生物学指南［M］.黄培堂，译.北京：科学出版社，2002：1067－1068.

［5］高锦声，郑斯荚，陈嘉政，等.人类染色体方法学手册：修订本［M］.南京：江苏省医学情报研究所，1981.

［6］谢志威，张晶，李卫凯.外周血染色体制备改良方法的应用［J］.国际检验医学杂志，2013，34（1）：82－83.

［7］张颖珍.人体外周血染色体G 显带制备时的影响因素及补救措施［J］.中国优生优育，2010，16（5）：265－267.

［8］慕明涛，霍满鹏，蒲力群，等.人外周血染色体标本制备失败的影响因素分析［J］.延安大学学报：医学科学版，2007，5（4）：3.

［9］桂俊豪，黄国香，王铮，等.Carnoy′s预固定剂量对中期染色体分散度的影响［J］.国际遗传学杂志，2006，29（6）：416－419.