黄伞胞外多糖发酵培养条件的响应面法优化

洒荣波，王　辉，鹿　慧，魏　梅，许盈盈，卜睿智（泰山医学院 生命科学学院，山东 泰安 271000）

黄伞胞外多糖发酵培养条件的响应面法优化

洒荣波，王辉，鹿慧，魏梅，许盈盈，卜睿智
（泰山医学院 生命科学学院，山东 泰安 271000）

采用P1ackett-Burman试验设计筛选显著影响多糖产量的培养条件，然后用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，最后通过Box-Behnken设计及响应面分析确定主要影响因素的最佳值。结果表明，多糖发酵培养条件为：初始pH值6.5、摇床转速209 r/min、装液量48 mL/250 mL、温度31℃、接种量10%、种龄90 h、培养时间180 h。在此最佳条件下，黄伞发酵胞外多糖产量可达7.44 g/L，比优化前提高了近2倍。利用响应面分析法优化黄伞胞外多糖发酵培养条件是可靠的，具有实际的应用价值。

黄伞；胞外多糖；培养条件优化；响应面分析

黄伞（Pho1iota adipose）又名柳蘑、黄蘑、多脂鳞伞，是一种食药兼用真菌［1］。其在国外分布于欧洲、美国、日本等地，在我国分布于山东、河北、山西、吉林、浙江、河南等多个地区。黄伞富含蛋白质、碳水化合物、维生素及多种矿物质元素，食之黏滑爽口，味道鲜美，风味独特，营养丰富，民间用于治疗肿瘤和肺疾［2］。近年来大量研究表明，黄伞多糖具有调节机体免疫力［3-5］、抗肿瘤［6-8］、降血脂［9-10］、抗菌［11-12］等生物学活性，更多的生物学专家将黄伞的研究作为当前的热点之一。

自然界黄伞子实体和人工栽培黄伞子实体由于周期长、产量低、成本较高，因而未得到全面开发。目前黄伞菌有效成分开发与应用主要途径是液态发酵法。为此，十分有必要对黄伞的深层发酵条件进行研究，以便用发酵液多糖代替子实体多糖作为食品、保健品或药品的原料。惠丰立等［13］采用摇瓶培养法对黄伞菌丝深层发酵培养条件进行了研究，运用正交试验法初步得出黄伞菌丝深层发酵较佳培养基配方和培养条件；贾永［14］也对黄伞深层培养条件进行了研究，但他们的研究中涉及到的碳源和氮源种类较少，对培养条件的研究也较单一，不够系统，不能全面地反映黄伞的培养状况和生物学特性。本研究采用响应面分析法应用Minitab 16和Design-Expert 8.0软件，优化了黄伞胞外多糖液体发酵的培养条件，以期为黄伞菌的大规模培养提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

黄伞（Pho1iota adiposa）：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号5.625。

1.1.2化学试剂

马铃薯、麸皮、黄豆饼粉：市售。

葡萄糖、蛋白陈、KH2PO4、MgSO4、VB1、硫酸铵、琼脂：天津市凯通化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.1.3培养基

①种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、麸皮2%、蛋白胨1%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、VB120 mg/L。

②发酵培养基：葡萄糖2%、麸皮2%、硫酸铵0.5%、黄豆饼粉1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。

1.2仪器与设备

BHC-1300无菌超净工作台：江苏泰诺源生物技术有限公司；HZ-88摇床：常州普天仪器制造有限公司；TGL-20M高速台式离心机：德国赛多利斯公司；pHS-3c型精密pH计：上海雷磁仪器厂；HHs型数显恒温水浴锅、UV 1900型双光束紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌种活化

将保藏于4℃冰箱的黄伞菌种无菌接至马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）平板，28℃培养7 d，待菌丝长满平板即可使用。

1.3.2摇瓶培养

摇瓶装液量50 mL/250 mL发酵培养基，接入10%的种子液，在旋转式摇床上转速为200 r/min、28℃条件下培养10 d，即为黄伞菌液体培养发酵液。

1.3.3胞外多糖产量的测定

胞外多糖产量的测定参照文献［15］进行。

1.3.4P1ackett-Burman试验设计

根据单因素试验，选取可能影响黄伞发酵胞外多糖产量的7个因素：初始pH值、温度、接种量、摇床转速、装液量、种龄、培养时间，用P1ackett-Burman设计对上述的7个因素进行考察，以胞外多糖产量（Y）为响应值，采用Minitab16软件进行试验设计和结果分析，试验设计因素与水平见表1。

表1　发酵条件优化Plackett-Burman试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5最陡爬坡试验

由P1ackett-Burman试验筛选出影响黄伞胞外多糖产量的关键因素后，进行最陡爬坡试验，使关键因素浓度最大限度靠近响应值极大区，步长及变化方向根据P1ackett-Burman试验结果得出。找出胞外多糖产量最高的发酵条件，即为响应面分析的中心点。

1.3.6Box-Behnken设计

根据P1ackett-Burman试验和最陡爬坡试验确定的试验因素和水平，采用Box-Behnken试验对黄伞胞外多糖发酵培养条件进行3因素3水平的响应面分析试验设计，采用Design-Expert 8.0软件进行试验设计和结果分析。试验的因素与水平见表2。

表2　Box-Behnken试验因素和水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2　结果与分析

2.1P1ackett-Burman试验筛选主要影响因子［16］

在前期单因素试验基础上，选用N=12的P1ackett-Burman试验设计，并预留3个空项作为误差分析，对初始pH值（A）、温度（B）、接种量（C）、摇床转速（D）、装液量（E）、种龄（F）和培养时间（G）7个因素进行考察，分别对应于表中的7列，每个因素取高（1）、低（-1）两个水平，高水平为低水平的1.25倍，响应值为黄伞胞外多糖产量（Y），P1ackett-Burman试验设计及响应面结果如表3所示，各因素的显著性及方差分析如表4所示。

表3　发酵条件优化Plackett-Burman试验设计及结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments for fermentation conditions optimization

表4　Plackett-Burman试验方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments

从表4可以看出，黄伞发酵产胞外多糖过程中，在α=0.05的显著水平上，初始pH值、摇床转速和装液量对多糖产量影响显著，可作为主要因素进行下一步的响应面试验。其他因素的取值可以根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素取较高值，负效应的因素取较低值。

2.2最陡爬坡试验结果

根据P1ackett-Burman试验结果，以主效应因素效应值方向为爬坡方向，固定其他因素为温度31℃、接种量10%、种龄90 h、培养时间180 h，确定初始pH值、摇床转速和装液量为3个主要影响因素，试验设计及结果如表5所示。从表5可以看出，第3组胞外多糖产量最高，为5.19 g/L，因此以第3组的因素水平作为响应面试验的中心点，即初始pH 值6.0、摇床转速210 r/min、装液量47.5 mL/250 mL。

表5　最陡爬坡试验设计及结果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3响应面试验优化黄伞发酵培养条件

2.3.1Box-Benhnken试验设计与分析

表6　Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

根据P1ackett-Burman试验和最陡爬坡试验确定的因素与水平，采用Box-Benhnken试验设计对黄伞发酵产胞外多糖发酵培养条件进行3因素3水平的响应面分析试验，并对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，在一定水平范围内求取最佳值。以黄伞发酵胞外多糖产量（Y）为响应值，以初始pH值、摇床转速、装液量为影响因子进行Box-Benhnken响应面分析，试验结果见表6。

2.3.2二次回归模型拟合及方差分析

应用Design Expert 8.0软件对表6的实验数据进行回归拟合，获得黄伞胞外多糖产量对初始pH、摇床转速和装液量的二次多项式回归方程为：

该二次多项模型及其各项的方差分析结果见表7。由表7可以看出，该模型的P值＜0.000 1，说明模型是极显著的；决定系数R2为0.995 0，这表明99.50%的试验数据可用此模型解释，因此回归方程拟合程度较好，其预测值与实验值的相关性极显著。失拟项P值为0.184 1＞0.05，说明该模型失拟不显著。对回归方程利用Design Expert 8.0软件进行分析，得到模型的极值点，即初始pH为6.5、摇床转速为209.2 r/min、装液量为47.7 mL/250 mL时，黄伞胞外多糖产量最高，预测值达到7.84 g/L。为实际操作方便，黄伞胞外多糖发酵条件确定为初始pH 6.5、摇床转速209 r/min、装液量48 mL/250 mL。其他发酵条件为温度31℃、接种量10%、种龄90 h、培养时间180 h。

表7　Box-Behnken试验回归方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation for Box-Behnken experiments

由响应面回归分析和回归方程拟合可以绘出响应面图形，结果见图1。由图1可知，摇床转速、初始pH值、装液量对多糖提取率的影响均呈抛物面型关系，且响应面均存在一个极大值点。其中摇床转速和初始pH值之间的交互作用最为显著。

图1　初始pH值、摇床转速和装液量交互作用对胞外多糖产量影响的响应面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH，shaking speed and liquid volume on exopolysaccharide yield

2.4模型验证试验

按照优化的黄伞发酵最佳培养条件进行了验证试验，黄伞发酵胞外多糖产量分别为7.64 g/L、7.23 g/L、7.45 g/L，平均值为7.44 g/L，为预测值的94.9%，表明该模型能较好地预测实际发酵情况。

3　结论

本实验经P1ackett-Burman试验确定初始pH值、摇床转速、装液量对黄伞发酵胞外多糖产量有显著影响。采用响应面分析方法，根据Box-Behnken中心组合试验，用DesignExpert 8.0软件处理实验数据，得到黄伞发酵胞外多糖产量回归模型，并取得了模型最优值时各因素水平。结果表明，黄伞胞外多糖发酵最佳培养条件为：初始pH值6.5、摇床转速209 r/min、装液量48 mL/250 mL，其他发酵条件为：发酵温度31℃、接种量10%、种龄90 h、培养时间180 h。在试验条件下，黄伞发酵胞外多糖产量可达7.44 g/L，比优化前提高了近2倍。与惠丰立等［13］利用单因素和正交试验进行的黄伞菌丝体多糖培养条件优化的试验相比效果更加明显。同时，通过回归方程得到的最大预测值与验证试验结果非常接近，说明利用响应面分析法优化黄伞胞外多糖发酵培养条件是可靠的，具有实际的应用价值。

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Optimization of fermentation conditions ofPho1iota adiposeexopo1ysaccharide by response surface methodo1ogy

SA Rongbo，WANG Hui，LU Hui，WEI Mei，XU Yingying，BU Ruizhi
（Schoo1 of Life Sciences，Taishan Medica1 University，Taian 271000，China）

P1ackett-Burman design was used to se1ect the fermentation conditions of significant impact on the po1ysaccharide yie1d，and then the path of steepest ascent was adopted to approach the optima1 region.Fina11y the optimum 1eve1s of the main inf1uencing factors were determined by Box-Behnken design and response surface ana1ysis.The resu1ts showed that the optimum fermentation conditions of exopo1ysaccharide were initia1 pH 6.5，shaking speed 209 r/min，1iquid vo1ume 48 m1/250 m1，temperature 31℃，inocu1um 10%，inocu1um age 90 h and cu1ture time 180 h.Under the optimum conditions，the yie1d ofPho1iota adiposeexopo1ysaccharide cou1d reach to 7.44 g/L，which was about 2 times than that of before the optimization.It was re1iab1e that the fermentation conditions ofP.adiposeexopo1ysaccharide were optimized by response surface ana1ysis，which had practica1 app1ication va1ue.

Pho1iota adipose；exopo1ysaccharide；fermentation conditions optimization；response surface ana1ysis

T992

A

0254-5071（2015）12-0069-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.015

2015-11-04

山东省自然科学基金项目（ZR2012CL02）

洒荣波（1978-），男，副教授，博士研究生，主要从事微生物发酵及生物活性物质应用研究工作。