应用组织芯片技术检测mTOR和VEGF在结肠癌中的表达

【摘 要】目的：探讨雷帕霉素靶蛋白（mTOR）与血管内皮生长因子（VEGF）在临床结肠癌患者中的表达，并针对两者与结肠癌病理参数之间存在的关联性。方法：选取72例结肠癌标本的组织芯片，采用免疫组化对mTOR以及VEGF进行检测，经过结果分析两者在结肠癌状态下与正常结肠组织中的表达，同时根据结果对mTOR、VEGF与结肠癌临床参数之间存在的关联性进行统计分析。结果：mTOR在结肠癌中的总表达率为42.5%，在正常结肠黏膜组织中的表达率为21.3%；VEGF在结肠癌中的总表达率为60.2%，在正常结肠黏膜组织中的表达率为40.4%，mTOR与VEGF在结肠癌当中的表达率明显高于在正常结肠黏膜组织中的表达率，比较差异具有统计学意义（P<0.05）。mTOR表达率与性别、年龄等患者基本资料之间无明显的相关性，但mTOR与VEGF在淋巴结转移情况、肿瘤浸润深度等情况呈明显的正相关性，mTOR与VEGF之间也存在明显的正相关性。结论：mTOR与VEGF可作为结肠癌发展中的重要指标进行观察，同时mTOR与VEGF也可以作为结肠癌的靶点应用于临床当中。

【关键词】雷帕霉素靶蛋白；血管内皮生长因子；结肠癌；组织芯片；免疫组化

Abstract：objective：to investigate the rapamycin target protein（mTOR）and vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in clinical patients with colon cancer，and for the correlation between pathological parameters with colon cancer.Methods：choose 72 cases of colon cancer specimens of tissue microarray，of the mTOR and VEGF by immunohistochemical detection，through the analysis of both in the condition of colon cancer and normal colon tissue expression，at the same time，according to the results of mTOR，correlation between VEGF and colon cancer clinical parameters were analyzed.Results：the total expression of mTOR in colon cancer at a rate of 42.5%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 21.3%；Total expression of VEGF in colon cancer at a rate of 60.2%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 40.4%，mTOR and the expression rate of VEGF in colorectal cancer were significantly higher than those in normal colonic mucosa tissue expression rate of comparative differences statistically significant（P < 0.05）.MTOR expression rate of patients with gender，age and other basic data have no obvious correlation between，but mTOR and VEGF in lymph node metastasis，tumor infiltration depth，and so on and so forth are obvious positive correlation，also exist obvious positive correlation between mTOR and VEGF.Conclusion：the mTOR and VEGF can be used as an important index to observe in colon cancer development，at the same time mTOR and VEGF can also be used as a target for clinical application of colon cancer.

Key words：rapamycin target protein；Vascular endothelial growth factor；Colon cancer；Tissue chip；immunohistochemical

近些年來结肠癌发病率的上升，主要是由于人们生活方式的改变，更多的食物摆上了餐桌，其中包含的大量致结肠癌物质使得结肠癌位于目前致死恶性肿瘤第5位的排名。据我国维生组织的统计结果表明，全球范围内的结肠癌发病率以每年3%的速度逐年递增，而我国则以每年4%的速度增加[1]。在以往针对结肠癌发生与发展的研究当中，认为结肠癌与多个步骤、多个癌基因、多个抑癌基因以及调控信号通路的异常变化之间有显著的相关性，多基因、多因素与多步骤成为了结肠癌特殊的发病机理。mTOR与VEGF是目前世界上生物学研究当中恶性肿瘤的研究热点之一，mTOR的作用在于能够感受营养信号，进而对细胞的生长与增殖能够起到关键的促进作用，在多种恶性肿瘤发生与发展的过程当中均存在明显的相关性与高表达率。本次研究采用免疫组织化学检验与组织微阵列针对mTOR与VEGF在结肠癌及正常结肠粘膜组织中的表达情况进行研究，进而探讨结肠癌生物学相关行为的临床意义。

1 材料及方法

1.1 标本选取

选取2011年-2015年某院实验室当中的72例结肠癌石蜡标本作为本次的研究对象，所有标本均通过2名以上的专业病理医师检查并确诊，另外选取原发癌灶边缘>2cm的正常结肠粘膜组织作为参照物。

1.2 组织芯片

在石蜡标本组织蜡块的选取当中，采用HE切片并针对具有代表性的病变部位进行确认，同时区分原发癌灶与正常粘膜组织，随后采用应用芯片组织构建仪对组织芯片进行制备。

1.3 检测方法

抗mTOR抗体选自英国ABcam公司（Dilution，1：50；Clone Y391），抗VEGF抗体选自美国Lab Vision公司（Dilution，1：200；Clone SP28），免疫组化试剂盒选取丹麦Dako公司的EnVision免疫组化试剂盒，采用EnVision二步法作为本次研究中的免疫组化技术，采用PBS代替一抗进行阴性对照[2]。

1.4 结果判断标准

mTOR主要存在于细胞浆当中，而VEGF则在细胞质与细胞浆当中均可定位，经染色后阳性标本呈淡黄色、棕褐色或棕黄色。阳性细胞数计分标准采用二级计分法，对5个高倍镜的视野对阳性细胞数进行统计：阳性细胞数<5%时，计0分；25%>阳性细胞数>5%时，计1分；50%>阳性细胞数>25%时，计2分；75%>阳性细胞数>50%时，计3分；阳性细胞数≥75%时，计4分。对染色强度进行分类后采用二级计分法，对染色后的阳性细胞进行统计：细胞呈淡黄色时，计1分；细胞呈黄色或深黄色时，计2分；细胞呈褐色或棕褐色时，计3分。将上述两组标准统计后的积分相乘，>1分时即可判定为阳性[3]。

1.5 统计学处理

本次研究当中的所有数据均采用SPSS17.0统计学软件进行处理，计数资料采用数（n）率（%）表示，数据相关性采用Spearman相关性检验。

2 结果

2.1 构建组织芯片

本次研究当中共构建成功1张组织芯片，其中包含了143个位点，脱落点采用常规切片予以补充。在癌组织当中，mTOR与VEGF染色的阳性细胞均呈片状并大面积出现，mTOR在细胞浆中表达率较高，且呈强阳性，正常结肠粘膜组织经染色后不着色，部分细胞呈弱阳性。VEGF在细胞浆与细胞质当中均表达率较高，且呈强阳性，正常结肠粘膜组织经染色后不着色。

2.2 原发癌与正常结肠粘膜组织中mTOR与VEGF的表达率

mTOR在结肠癌组织当中的表达率为42.5%，可随着肿瘤的发生与发展逐渐增加，在正常结肠粘膜组织中的表达率为21.3%；VEGF在结肠癌组织当中的表达率为60.2，在正常结肠粘膜组织中的表达率为40.4%。结肠癌组织中的mTOR与VEGF的表达率均明显高于在正常结肠粘膜组织中的表达率，比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 mTOR與VEGF阳性表达与结肠癌临床病理参数的相关性

mTOR表达率与患者的性别、年龄均无明显的关联性，与恶性肿瘤的淋巴结转移及远处转移、浸润深度均呈明显的正相关性，VEGF表达率与恶性肿瘤的淋巴结转移及远处转移、浸润深度呈明显的正相关性，具体数据见表1。

2.4 mTOR与VEGF的相关性

经Spearman相关性检验结果显示，mTOR与VEGF之间存在显著的相关性。mTOR与VEGF在结肠癌当中的共同表达率为37.8%（r=0.351，P<0.05），结果表明两者之间存在明显的正相关性。

表1 mTOR及VEGF阳性表达与结肠癌临床病理参数的相关性[n（%）]

临床参数 病例数 mTOR+ VEGF+

性别

男 45 20（44.44） 27（60.00）

女 27 13（48.15） 19（70.37）

年龄

<60 39 15（38.46） 23（58.97）

≥60 33 18（54.55） 21（63.64）

浸润深度

粘膜层与肌层 29 11（37.93）* 15（51.72）*

浆膜层及浆膜外 43 23（53.49） 31（72.09）

淋巴结转移

阳性 34 21（61.76）* 30（88.24）**

阴性 38 14（36.84） 16（42.11）

远处转移

阳性 24 21（87.50）** 19（79.17）**

阴性 48 12（24.00） 23（47.92）

注：*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

mTOR属于苏氨酸激酶/丝氨酸的一种，在营养信号的感受、细胞生长与增值当中具有极强的调节作用，通常情况下，细胞的增长与能量状态、血液供给情况以及营养等因素具有极强的相关性，mTOR能将这些因素进行整合，对细胞的生长进行调节[4]。与正常细胞相同的是，癌细胞的成长也需要能量、营养以及血液的供给，因此VEGF存在的介导生物学作用在恶性肿瘤的发生与发展过程当中能够起到重要的作用[5]。本次研究结果表明，在正常的结肠粘膜组织当中，mTOR基本不表达，在恶性肿瘤组织当中，mTOR的表达率为42.5%，而VEGF在恶性肿瘤组织当中的表达率则高达60.2%，mTOR与VEGF之间也存在明显的正相关。

本次研究针对mTOR与VEGF在结肠癌的发生、发展以及转移当中据存在明显的作用，在临床研究中不仅能够对结肠癌的发生、转移机制进行深入的了解，同时也能成为恶性肿瘤的待选治疗靶点，在临床当中具有重要的实际价值与意义。

参考文献：

[1]王强，郑海涛，丁德祥.结直肠癌的流行病学和筛查进展[J].中国现代医生，2010，46（18）：103-104.

[2]Jin G，Ramanathan V，Quante M，et al.Inactivating cholecystokinin-2 receptor inhibits progastrin-dependent colonic crypt fission，proliferation，and colorectal cancer in mice[J].J Clin Invest，2011，119（9）：2691-2701.

[3]Kwon YS，Hong HS，Kim JC，et al.Inhibitory effect of rapamycin on corneal neovascularization in vitro and in vivo[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2014，46（2）：454-460.

[4]Andrade MA，Bork P.HEAT repeats in the Huntingtons disease protein[J].Nat Genet，2010，11（2）：115-116.

[5]Kononen J，Bubendorf L，Kallioniemi A，et al.Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens[J].Nat Med，2011，4（7）：844-847.

项目名称：检测mTOR蛋白在结直肠癌中的表达及靶向抑制药物对人结肠癌细胞的作用机理，项目来源：吉林省科技厅，项目编码：3D512J803430，项目负责人：高硕徽。