盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的不同提取方法比较研究*

雷震，雷攀，，杜士明，，杨光义，魏晋宝，叶方，张晨宁

（1.湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000；2.湖北中医药大学，湖北武汉430065）

盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的不同提取方法比较研究*

雷震1，雷攀1，2，杜士明1，2，杨光义2，魏晋宝2，叶方2，张晨宁2

（1.湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000；2.湖北中医药大学，湖北武汉430065）

目的对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的5种常用提取方法进行比较研究，为后期新方法新工艺的建立及工业应用提供依据。方法以薯蓣皂苷元得率、纯度为指标，经标准化处理，以综合评价值（W）对直接酸水解法、阶梯生物酶法、复合生物酶法、预发酵法、浸提分离法5种提取方法进行比较。结果5种方法W值由大到小顺序为：阶梯生物酶法＞复合生物酶法＞浸提分离法＞预发酵法＞直接酸水解法。结论阶梯生物酶法提取盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元效果较好。

盾叶薯蓣；薯蓣皂苷元；提取方法

薯蓣皂苷元亦称薯蓣皂素，主要由薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino、盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensis C.H.Wright根茎中所含的薯蓣皂苷（Dioscin，Dio）水解脱去糖基而得，是一种重要的药物中间体［1］。目前，以薯蓣皂苷元为原料合成的口服避孕药、肾上腺皮质激素类药物有100余种，其需求量仅次于抗菌药物［2-3］。在工业生产中，主要采用酸水解法获取薯蓣皂苷元，此法先以强酸水解薯蓣皂苷糖苷键，再以汽油为溶剂萃取皂苷元，其主要缺点是污染环境、存在安全隐患，也浪费水资源，且薯蓣皂苷元得率较低（1.3%左右）［4］。因此，需建立一种清洁、安全、高效的提取方法。近年关于薯蓣皂苷元提取新方法的研究报道较多，不同方法薯蓣皂苷元得率差异较大。本课题组对5种常用提取方法进行了比较研究，为后期新方法、新工艺的建立及工业应用提供依据。

1 仪器与材料

戴安UltiMateTM3000型高效液相色谱（HPLC）仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chromeleon软件数据处理系统（美国戴安公司）；SPX-2501-G型微电脑光照培养箱；ZHWY-2102C型立式双层恒温摇床；AUW-120D型电子分析天平（日本岛津）；RE-2000A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TDL-5A型离心机（德国菲恰尔公司）；VORTEX-5型漩涡混合器；pHS-25型数显pH计（上海精密科学仪器有限公司）；SKFO-0型电热鼓风恒温干燥箱。盾叶薯蓣由湖北神农本草中药饮片有限公司提供，经湖北医药学院生药学教研室主任陈吉炎教授鉴定为薯蓣科植物盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensis C.H.Wright的根茎，粉碎，过4号筛，备用；薯蓣皂苷元化学对照品（中国药品生物制品检定所，批号为111539-200001）；复合纤维素酶（Viscozyme L）、淀粉酶（BAN 480L）、糖化酶（AMG 300L）均购自诺维信中国生物技术有限公司；甲醇为色谱纯，水为纯化水，环己烷、硫酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取方法

直接酸水解法［5］：取盾叶薯蓣粉末50 g，置500mL圆底烧瓶中，加2mol/LH2SO4溶液200mL，进行后处理。100℃水解4 h，3 000 r/min离心3min，弃上清液；取沉淀以10%NaOH溶液调节pH至中性，离心，弃上清液；沉淀100℃烘干，研碎，加环己烷回流提取4 h，离心，收集上清液，沉淀加适量环己烷洗涤，离心，2次上清液合并，减压回收环己烷，收集结晶，100℃烘干，称重，得样品A1，备用。

阶梯生物酶法［6］：取盾叶薯蓣粉末50 g，置500mL圆底烧瓶中，加150mL水混匀，以NaH2PO4溶液调pH至6.0，加复合纤维素酶500μL，置培养箱中50℃酶解2 h；取出，调pH至5.5，加淀粉酶750μL，75℃酶解2 h；取出，加糖化酶500μL，60℃酶解2 h。3 000 r/min离心3 min，弃上清液，沉淀100℃烘干，研碎，称重，加2mol/LH2SO4溶液90mL。后续处理同直接酸水解法，得样品A2，备用。

复合生物酶法［7-8］：取盾叶薯蓣粉末50 g，置500 mL圆底烧瓶中，加150 mL水混匀，以NaH2PO4溶液调pH至5.5。依次加入复合纤维素酶500μL，淀粉酶750μL，糖化酶500μL，置培养箱中50℃酶解2 h后升温至65℃酶解4 h。3 000 r/min离心3min，弃上清液，沉淀100℃烘干，研碎，称重，加2mol/LH2SO4溶液90mL。后续处理同直接酸水解法，得样品A3，备用。

预发酵法［9-10］：取盾叶薯蓣粉末50 g，置500 mL圆底烧瓶中，加200mL水混匀，置发酵摇床中，35℃，200 r/min发酵48 h。3 000 r/min离心3min，弃上清液，沉淀100℃烘干，研碎，称重，加2 mol/L H2SO4溶液180 mL。后续处理同直接酸水解法，得样品A4，备用。

浸提分离法［11-13］：取盾叶薯蓣粉末50 g，置500 mL圆底烧瓶中，以1∶7料液比加90%乙醇溶液，80℃回流提取2 h，3 000 r/min离心3min，收集上清液，沉淀再提取2次，合并3次上清液，回收乙醇，得浸膏，干燥，研碎，称重，加2mol/LH2SO4溶液25mL。后续处理同直接酸水解法，得样品A5，备用。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），前加Waters Atlantis T3预柱（200 mm×4.6mm，3μm）；流动相：甲醇；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测波长：203 nm；进样量：10μL。在此条件下的色谱图见图1。

2.2.2 溶液制备

图1 高效液相色谱图

称取薯蓣皂苷元对照品（用P2O5减压干燥12 h）12.5mg，精密称定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，得质量浓度为2.5 g/L的对照品贮备液。称取薯蓣皂苷元样品A1至A5各10mg，精密称定，分别置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，以0.45μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液A1至A5。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品贮备液并稀释，配制成质量浓度为1.5，1.0，0.5，0.2，0.1，0.05，0.02 g/L的对照品溶液，按拟订色谱条件进样分析。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=71.536 X-0.417 4，r=0.9995（n=7）。结果表明，薯蓣皂苷元质量浓度在0.02～1.5g/L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取线性关系考察项下配制的质量浓度为0.5 g/L的对照品溶液，按拟订色谱条件进样分析，重复进样6次。结果峰面积的RSD为1.05%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密称取薯蓣皂苷元样品A210mg，依法制备供试品溶液，分别于0，1，2，4，8 h时按拟订色谱条件进样分析。结果峰面积的RSD为1.49%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

重复性试验：精密称取薯蓣皂苷元样品A210mg，共6份，分别依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析。结果薯蓣皂苷元的平均含量为0.832 2 g/L，RSD=1.74%（n=6），表明该方法重复性较好。

加样回收试验：精密称取已知含量的薯蓣皂苷元样品9份，依法制备供试品溶液，精密量取各供试品溶液1.0 mL，分别精密加入质量浓度为0.8 g/L的薯蓣皂苷元对照品溶液0.8，1.0，1.2mL，按拟订色谱条件进样分析，计算回收率。结果见表1。

表1 薯蓣皂苷元加样回收试验结果（n=9）

2.3 样品含量比较

取供试品溶液A1至A5，分别按拟订色谱条件进样分析，由标准曲线法求样品质量浓度，通过计算得出薯蓣皂苷元得率和纯度，结果见表2。以薯蓣皂苷元得率和纯度为指标，对以上5种方法进行比较，为消除各指标量纲的不同及各指标量变范围不同造成的影响，将各指标数据按公式X′ij=（Xij-Xj）/Sj进行标准化处理［14］，式中X′ij为标准化的值，Xij为样品液i中成分j的含量，Xj为各种样品液i中成分j的平均值，Sj为成分的标准偏差。在薯蓣皂苷元生产中得率和纯度同等重要，故2个指标的权重系数均设为0.5。按以下公式计算综合评价值，W=（X′得率+X′纯度）× 0.5。5种提取方法的W值由大到小顺序为：阶梯生物酶法＞复合生物酶法＞浸提分离法＞预发酵法＞直接酸水解法，详见表2。

表2 不同工艺提取薯蓣皂苷元含量测定结果（n=3）

3 讨论

比较5种薯蓣皂苷元的提取方法，阶梯生物酶法和复合生物酶法综合提取效果优于其他方法。直接酸水解法目前在工业生产中应用最广泛，其工艺简单、生产成本低，但环境污染严重、资源利用率低、皂苷元得率低，正逐步被淘汰；预发酵法在工业生产中应用也较广泛，在酸水解前对盾叶薯蓣进行自然发酵处理，可将皂苷元得率在直接酸水解法基础上提高7.6%，但其发酵过程复杂，可控性差，薯蓣皂苷元得率仍较低，也逐步被淘汰；浸提分离法H2SO4用量为直接酸水解法的12.5%，可在一定程度上改善生产过程中环境污染问题，但薯蓣皂苷元得率比直接酸水解法还低12.4%，限制了该方法的推广。阶梯生物酶法和复合生物酶法在酸水解前应用生物酶技术对盾叶薯蓣进行预处理，可使酸用量减少55%，薯蓣皂苷元得率提高50%，纯度提高10%以上，并且盾叶薯蓣经酶处理可获得副产品葡萄糖。此方法虽然成本略高于直接酸水解法，但综合效益明显提高，故将生物酶技术应用于薯蓣皂苷元生产具有较好的市场前景。

盾叶薯蓣中约含薯蓣皂苷3%、淀粉37%、纤维素45%，由于淀粉和纤维素的包裹，阻碍了皂苷的水解［15］，故直接酸水解法只能提取出盾叶薯蓣中45%的薯蓣皂苷元成分［6］。阶梯生物酶法、复合生物酶法在酸水解前，用生物酶对盾叶薯蓣进行预处理，分解了大部分淀粉和纤维素，从而较大幅度提高了皂苷元得率。此外，淀粉和纤维素的存在，会增加H2SO4用量，阶梯生物酶法和复合生物酶法在酸解前分解掉大部分的淀粉和纤维素，有效降低了H2SO4的用量。

试验中还考察了HPLC法测定薯蓣皂苷元含量的色谱条件。根据文献报道并结合薯蓣皂苷元化学特性，考察了薯蓣皂苷元在203 nm［16］，206 nm［17］，209 nm［18］波长处吸收情况，结果在203 nm处有最大吸收。对甲醇、甲醇-水（95∶5）、甲醇-水（85∶15）、乙腈-水（90∶10）、乙腈-水（80∶20）为流动相等度洗脱及乙腈-水梯度洗脱的洗脱效果进行考察，结果以纯甲醇为流动相时，色谱图基线稳定，峰形较好，薯蓣皂苷元保留时间合理。本试验中还考察了3种不同色谱柱的分离效果，发现Waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱的分离效果较好。经方法学考察，所选色谱条件符合测定要求，故使用其进行薯蓣皂苷元含量测定。

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Comparison of Different Extraction Methods of Diosgenin from Dioscorea Zingeberensis

Lei Zhen1，Lei Pan1，2，Du Shiming1，2，Yang Guangyi2，Wei Jinbao2，Ye Fang2，Zhang Chenning2
（1.Department of Pharmacy，Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China 442000；2.Hubei University of Chinese
Medicine，Wuhan，Hubei，China 430065）

Objective To provide foundation for new method and process′s optimization and establishment by comparing 5 diosgenin extraction methods of Diosgenin from Dioscorea Zingeberensis.Methods The diosgenin yield and purity were set as the indexes，and after standardization treatment，the direct acid hydrolysis（DACP），ladder enzymatic（LEP），composite enzymatic（CEP），prefermentation（PMP）and extraction separation methods（ESP）were compared by the comprehensive evaluation value（W）.Results The W of the 5 methods is as follows：LEP＞CEP＞ESP＞PMP＞DACP.Conclusion LEP has good effect for extracting the diosgenin from Dioscorea Zingeberensis.

Dioscorea zingeberensis；diosgenin；extraction method

R284.2；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0024-03

雷震（1969-），男，主管药师，研究方向为医院药学，（电子信箱）123492306@qq.com；杜士明，男，博士研究生，教授，硕士研究生导师，研究方向为制剂研究与开发，本文通讯作者，（电话）0719-8801163（电子信箱）dsmch@sina.com。

2015-05-07；

2015-07-04）

*2013年湖北省科技支撑计划（对外科技合作类）项目，项目编号：2013BHE017；2014年湖北省教育厅中青年创新团队项目，项目编号：T201414。