内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路在苦参碱诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡中的作用

来小丹，欧阳净，石英

（中国人民解放军第三军医大学第一附属医院药剂科，重庆400038）

内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路在苦参碱诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡中的作用

来小丹，欧阳净，石英

（中国人民解放军第三军医大学第一附属医院药剂科，重庆400038）

目的探讨内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路在苦参碱诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡中的作用。方法采用0，1.0，2.0，4.0 g/L苦参碱处理HOX-Rb44细胞24 h，MTT、流式细胞术分析细胞增殖活性及凋亡情况，Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2，内质网应激相关蛋白GRP94，GRP78，ATF4以及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表达水平。结果随着苦参碱质量浓度的增加，HOX-Rb44细胞增殖抑制增加，凋亡率显著升高（P＜0.05），GRP78与GRP94的表达水平逐渐升高，ATF及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表达升高。结论苦参碱处理视网膜母细胞瘤细胞能诱导细胞凋亡，内质网应激、PERK-ATF4-CHOP通路可能在其中有重要作用。

内质网应激；苦参碱；视网膜母细胞瘤；细胞凋亡

视网膜母细胞瘤（Rb）是小儿科常见的眼内恶性肿瘤，发病率居眼内恶性肿瘤的首位，严重威胁患儿的视力及生命［1］。在尚未扩展期对该病患儿给予及时治疗，存活率可达95%［2］。内质网应激是介导细胞凋亡的独立于死亡受体和线粒体途径的第3条凋亡通路，近年研究表明，其参与帕金森病及阿尔茨海默病等疾病的发病，对神经细胞的凋亡有重要作用。内质网发生应激时蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）与Bip解离，PERK自身磷酸化被激活，磷酸化eIF2，抑制蛋白反应过程，包括下游激活转录因子4（ATF4），ATF4作为转录因子上调内质网分子伴侣和参与氨基酸转运蛋白质的转录表达，有助于恢复内质网稳态［3］。ATF4持续过表达将促进细胞凋亡诱导基因的表达上调，如转录因子CHOP等［4］，最终导致细胞死亡［5］。苦参碱是苦参生物碱的主要活性成分。近年临床及药理学研究表明，苦参碱具有抗纤维化、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等作用，能抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡作用，此外，张璐烨［6］的研究显示，苦参碱能促进HOX-Rb细胞凋亡，减少Rb细胞mRNA表达，降低细胞端粒酶活性，抑制细胞增殖。本研究中对内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路在苦参碱诱导Rb细胞凋亡中的作用，为寻找药物干预关键节点，发现潜在的药物作用靶点，为Rb临床药物的研发提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 仪器与试药

流式细胞仪FACSAriaTM及分析软件（美国BD公司）；荧光显微镜（美国Leica公司）；多功能离心机（瑞士Tecna公司）；垂直电泳槽（美国Bio-rad公司）；CO2培养箱（Sanyo公司，日本）。磷酸盐缓冲液（PBS），RPMI-1640培养基（Gibcol），胎牛血清（Hyclone）；注射用青霉素钠，注射用硫酸链霉素，四氮唑盐（MTT），软琼脂，吖啶橙（AO），溴化乙啶（EB）均购自sigma公司；苦参碱注射液（广州白云山明兴制药有限公司，国药准字H10950071，规格为每支5 mL∶50 mg）。Model 550酶标仪（美国Bio-rad公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo Forma公司）；Hoechst 33342（北京雷根生物技术有限公司），人Rb细胞株（HXO-Rb44）来源于中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，一抗PERK，ATF4，CHOP及peIF2α等抗体购自Cell Signal公司。

1.2 方法

HXO-Rb44细胞培养：将细胞接种在含有RPMI-1640培养基，于37℃及5%CO2培养箱中培养。细胞悬浮生长，显微镜观察细胞生长状况及形态。培养1～2 d进行传代，以离心半径8 cm，1 200 r/min 4℃离心15min，弃上清液，加入配置好的含有10%胎牛血清、50 U/mL链霉素、青霉素的RPMI-1640培养基。细胞对数生长期加入不同质量浓度苦参碱处理，对照组给予等量RPMI-1640培养基，培养箱中培养24 h。

MTT法观察细胞增殖情况：对数生长期HXO-Rb44细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度为20×104/mL，每孔种100μL细胞悬液加入不同质量浓度苦参碱溶液（1.0，2.0，4.0 g/L），并设置空白对照组，每孔加MTT溶液20μL，37℃继续培养4 h后，终止培养，加二甲基亚砜（DMSO）200μL，避光振荡15min混匀后，比色。肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-试验组A490值/对照组A490）×100%。

细胞形态学观察：收集细胞，加固定液，4℃固定10～20min，弃固定液，PBS洗2遍，弃上清液，保留约50μL，混匀后滴加在载玻片上，使细胞均匀分布，稍晾干后加500μLHoechst33342染液，染色5 min，吸水纸边缘吸干后，PBS洗2遍，滴加抗荧光淬灭，荧光显微镜观察。

流式细胞仪检测细胞凋亡：将悬浮细胞直接收集到10mL离心管中，每个样本有（1～5）×106个/mL细胞，1 000 r/min离心5min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，离心5min。用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min。离心5 min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不时振动。流式细胞仪分析，激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测异硫氰酸荧光素（FITC）荧光，另一波长于560 nm的滤器检测碘化丙啶（PI）。

Western Blot检测：收集细胞，加200μL裂解液（50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.0，150 mmol/L PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制剂）。4℃，以离心半径8 cm，12 000 r/min离心15min，取上清液，采用Bradford法检测蛋白浓度；取上述制备的蛋白样品50μg与等体积样本缓冲液混合，沸水中加热10min，冷却后上样到15% SDS-PAGE凝胶，电泳完毕后将蛋白电转至硝酸纤维（NC）膜，转膜后考马斯亮蓝染色凝胶，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭，分别加一抗，37℃孵育2 h，经0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X线胶片定影，扫描后用IPP 6.0进行图像分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度苦参碱对细胞增殖的影响

以MTT法检测不同质量浓度苦参碱对HXO-Rb44增殖的影响，结果显示其抑制率随剂量增加而上升，呈明显的剂量依赖性，处理质量浓度增加，吸光度降低，HXO-Rb44增殖抑制率显著增加（P＜0.05），见表1。

表1 不同质量浓度苦参碱对HXO-Rb44增殖的影响（±s）

表1 不同质量浓度苦参碱对HXO-Rb44增殖的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

抑制率（%）0 g/L 6±0.045 3.72±0.021 1.0 g/L 1.426±0.038*17.21±1.161*2.0 g/L 1.018±0.044*36.52±2.461*4.0 g/L 0.864±0.037*49.52±3.047*

2.2 苦参碱处理后细胞凋亡情况

采用Hoechst33342/PI分析苦参碱处理后，随着处理质量浓度的提高，HXO-Rb44细胞出现凋亡细胞核浓缩，呈现出亮蓝色，在2.0 g/L和4.0 g/L苦参碱处理后死亡细胞被PI染色，见图1。流式检测细胞凋亡情况，结果显示1.0，2.0，4.0 g/L苦参碱处理组对应的凋亡率分别为13.8%，21.9%及53.1%，显著高于对照组。见图2。

图1 Hoechst33342/PI染色后荧光显微镜（×200）细胞凋亡情况

图2 FCM检测苦参碱处理后HXO-RB44细胞凋亡情况

2.3 PERK-ATF4-CHOP通路相关蛋白表达水平分析

Western blot法检测了HOX-Rb44细胞GRP94及GRP78及凋亡相关蛋白的表达水平，显示随着苦参碱质量浓度的提高，HOX-Rb44细胞GRP78与GRP94的表达水平逐渐升高，提示高质量浓度苦参碱会诱导内质网应激。进一步分析了ATF4及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表达水平，显示随着苦参碱质量浓度的提高，ATF4及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表达水平升高，见图3和表2。

3 讨论

图3 HOX-Rb44细胞GRP94，GRP78及凋亡相关蛋白的表达水平

表2 苦参碱作用后HOX-Rb44细胞相关蛋白定量分析结果（±s）

表2 苦参碱作用后HOX-Rb44细胞相关蛋白定量分析结果（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

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肿瘤的发生不仅由于细胞高增殖率，也与细胞凋亡受抑制有关，原癌基因的激活以及抑癌基因的失活，扰乱细胞的正常增殖、分化及凋亡，导致细胞增殖过度，分化不足，最终发展为肿瘤［7］。肿瘤治疗往往是选择快速分裂的细胞为靶细胞，但临床学这种解释差强人意［8］，可治疗的癌症有时生长缓慢，而抗药性的癌症也可能快速分裂，多项研究表明，治疗可能是在肿瘤细胞中诱导凋亡，细胞凋亡试验也是一种筛选抗癌药物的快捷、有效的方法［9-10］。苦参碱是由中药苦参中分离出的一类活性物质，是苦参生物碱的主要活性成分［11］，具有抗纤维化、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等作用，能抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡［12］。苦参碱还能通过干扰细胞周期、降低端粒酶活性［13］、调控凋亡基因等多种机制，抑制肿瘤细胞分化和增殖，诱导凋亡［14-15］。

PERK是内质网膜上的跨膜蛋白，与GRP78解离后形成同源二聚体，并发生自身磷酸化被激活，PERK磷酸化被激活后使eIF2α磷酸化，并抑制其翻译其实因子的功能，抑制大多数mRNA的翻译，从而减少蛋白质的合成，减少内质网负荷，有助于恢复内质网的折叠和稳态［16］。eIF2α磷酸化能够抑制大多数mRNA的翻译，但ATF4mRNA翻译增强，使ATF4合成增加，ATF4合成后转录到细胞核内，作为转录因子上调内质网分子伴侣和参与氨基酸转运蛋白质的转录表达，同样有助于恢复内质网稳态。如无法恢复内质网的稳态，将导致细胞死亡。研究表明，在缺乏PERK及ATF4的癌细胞中，在缺氧条件下细胞凋亡水平显著增加，PERK-eIF2-AFT4通路在体内或体外环境下肿瘤细胞适应缺氧应激的重要因素。董传芳等［17］的研究显示，内质网应激在AGE-BSA诱导视网膜母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡，且内质网相关蛋白GRP78，peIF2α及Caspase-12表达水平呈时间依赖性。

本研究中分别用不同质量浓度苦参碱处理细胞24 h，结果显示，随着苦参碱质量浓度的增加HOX-Rb44细胞凋亡率显著升高；进一步分析内质网应激在苦参碱在诱导HOX-Rb44细胞凋亡中的作用，采用Western blot检测了HOX-Rb44细胞GRP94及GRP78的表达水平，显示GRP78与GRP94在处理组显著较对照组升高；本研究中还分析了PERK信号通路peIF2α，ATF4及CHOP蛋白表达水平，显示苦参碱处理24 h后HOX-Rb44细胞peIF2α及CHOP蛋白表达水平显著升高。蛋白聚集激活eIF2a激酶-PERK并引起未折叠蛋白反应，触发内质网应激，eIF2a的磷酸化亦会导致翻译的普遍抑制，其中包括ATF4。而CHOP被PERK下游转录因子ATF4等诱导，启动GADD34，Bim等基因，触发细胞凋亡。因此，采用苦参碱处理Rb细胞能诱导细胞凋亡，出现内质网应激，PERK-ATF4-CHOP信号通路可能在其中有重要作用。

［1］宋芳，毕婧玮，韩宇，等.视网膜母细胞瘤患儿家长亲职压力及其相关因素的调查研究［J］.中国实用护理杂志，2013，29（z2）：2.

［2］曾洵.多西紫杉醇及联合卡铂对人视网膜母细胞瘤株SORB50的增殖抑制［D］.昆明：昆明医学院，2008.

［3］Bejarano-Escobar R，Blasco M，Durán AC,et al.Chronotopographical distribution patterns of cell death and of lectin-positive macrophages/microglial cells during the visual system ontogeny of the small-spotted catshark Scyliorhinus canicula［J］.JAnat，2013，223（2）：171-184.

［4］Notte A，Rebucci M，Fransolet M,et al.Taxol-induced unfolded protein response activation in breast cancer cells exposed to hypoxia：ATF4 activation regulates autophagy and inhibits apoptosis［J］.Int JBiochem Cell Biol，2015，62：1-14.

［5］Dai ZJ，Wang XJ.Association between APE1 Single Nucleotide Polymorphism（rs1760944）and Cancer Risk：a Meta-Analysis Based on 6，419 Cancer Cases and 6，781 Case-free Controls［J］.JCancer，2014，5（3）：253-259.

［6］张璐烨.苦参碱对视网膜母细胞瘤细胞survivin和端粒酶活性表达的影响［J］.医学研究杂志，2013，42（8）：120-122.

［7］Bertin-Ciftci J，BarréB，Le Pen J,et al.pRb/E2F-1-mediated caspase-dependent induction of Noxa amplifies the apoptotic effects of the Bcl-2/Bcl-xL inhibitor ABT-737［J］.Cell Death Differ，2013，20（5）：755-764.

［8］吴林林.全反式维甲酸联合放射线照射对食管癌细胞周期、凋亡及NF-κB、β-catenin、CyclinD1表达的影响［D］.石家庄：河北医科大学，2008.

［9］林桂凤，刘银燕.去甲斑蝥素诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究［J］.中国药房，2007，18（16）：1 266-1 267.

［10］Hong S，Fang W.Risk of treatment-related deaths with vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors：a meta-analysis of 41 randomized controlled trials［J］.Onco Targets Ther，2014（7）：1 851-1 867.

［11］李哲清，方丽.苦参碱对人视网膜母细胞瘤细胞体外生长增殖的影响［J］.中国中医眼科杂志，2011，21（3）：139-141.

［12］王文战.氧化苦参碱诱导视网膜母细胞瘤细胞株SM-106凋亡的研究［J］.中国现代药物应用，2009，3（15）：83-84.

［13］Ding PL，Liao ZX.（+）-12alpha-Hydroxysophocarpine，a new quinolizidine alkaloid and related anti-HBV alkaloids from Sophora flavescens［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16（5）：1 231-1 235.

［14］申晓东，宋关斌，严润彬.苦参碱和氧化苦参碱抗肿瘤作用的研究进展［J］.重庆大学学报：自然科学版，2005，28（6）：125-128.

［15］韦玉脉，黄赞松.苦参素抗肿瘤作用实验与临床研究进展［J］.右江民族医学院学报，2008，30（4）：639-641.

［16］王辉，叶燕，禹志领，等.冬凌草甲素对HepG2细胞内质网应激蛋白IRE-1、PERK和CHOP的作用研究［J］.中药新药与临床药理，2012，23（3）：263-266.

［17］董传芳，刘雪平，徐松，等.糖基化终末产物对SH-SY5Y细胞内质网应激的影响［J］.卒中与神经疾病，2012，19（2）：67-71.

Role of Endoplasmic Reticulum Stress PERK-ATF4-CHOP Pathway in Matrine Induced Retinoblastoma Apoptosis

Lai Xiaodan，Ouyang Jing，Shi Ying
（Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of The Third Military Medical University，Chongqing，China 400038）

Objective To analyze the role of endoplasmic reticulum stress PERK-ATF4-CHOP pathway in matrine induced retinoblastoma cells apoptosis.Methods Different concentrations of 0,1.0,2.0,4.0 g/L matrine was used to treat the HOX-Rb44cells for 24 h，the cell viability was determined by MTT assay,HOX-RB44 apoptosis situation was determined by ow cytometry，western blot analysis was used to dectect the Bax，Bcl-2，GRP78，GRP94，AFT4，peIF2αand CHOP expression.Results As the increase of concentration of matrine，HOX-Rb44apoptosis rate increased significantly（P＜0.05）,GRP78 and GRP94 increased significantly,and ATF and PERK downstream peIF2αand CHOP were also increased significantly.Conclusion Matrine could promoted HOX-Rb44cell apoptosis,endoplasmic reticulum stress,where PERK-ATF4-CHOP pathway may play an important role.

endoplasmic reticulum stress；matrine；retinoblastoma；cell apoptosis

R285.5；R286

A

1006-4931（2015）22-0056-03

来小丹，女，硕士研究生，主管药师，主要从事药品采购工作，（电话）023-68754953（电子信箱）xiaodan-lai@ sina.com。

2015-05-13；

2015-08-04）