CaMKⅡ-p38通路在异丙酚诱导神经干细胞凋亡中的作用

王洪梅

（重庆市肿瘤研究所，重庆400030）

CaMKⅡ-p38通路在异丙酚诱导神经干细胞凋亡中的作用

王洪梅

（重庆市肿瘤研究所，重庆400030）

目的分析不同浓度异丙酚对神经干细胞凋亡的影响及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用。方法取孕14 d大鼠分离胚胎神经干细胞，分为异丙酚低、中、高浓度组（A1，A2，A3组），对照组（B组）及溶剂组（C组），A1，A2，A3组分别给予质量浓度2.5，5.0及10.0μg/mL异丙酚处理，B组不作处理，C组给予脂肪乳替代异丙酚，分析各组细胞增殖及凋亡情况，Western Blot法分析CaMKⅡ及p38的表达情况。结果A组处理12 h后细胞增殖率无显著性差异（P＞0.05），处理48，72 h后呈现出浓度和时间依赖性；与B组相比，C组细胞凋亡率与死亡率无显著性差异（P＞0.05），A1，A2，A3组凋亡率和死亡率显著升高（P＜0.05），且呈现剂量依赖性；随着异丙酚处理浓度的提高，P-p38及P-CaMKⅡ的表达量显著升高（P＜0.05）。结论不同浓度异丙酚处理会抑制神经干细胞增殖促进凋亡，CaMKⅡ-p38通路有重要作用，为临床麻醉用药的合理性和安全性提供试验基础。

异丙酚；神经干细胞；凋亡；CaMKⅡ；p38

异丙酚是广泛应用于临床麻醉诱导和维持以及重症患者镇静的静脉麻醉药物［1］，通过激活γ-氨基丁酸（GABA）受体-氯离子复合物发挥对中枢神经系统的作用。近期研究显示，异丙酚能改变突触的可塑性，对患者记忆和认知功能造成不利影响，其神经毒性作用可能会引起患者术后认知功能的减退［2］。本研究以体外培养的大鼠神经干细胞为模型，探讨不同浓度的异丙酚对神经干细胞的增殖和凋亡的影响以及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用，为临床麻醉用药的合理性和安全性提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

C57/BL小鼠购自南京君科生物科技有限公司（货号为J006）；DMEM/F12培养基购自HyClone公司；异丙酚（批号为ET763，10 mg/mL，AstraZeneca公司）；p38，p-CaMKⅡ抗体购自Avcam公司。细胞培养箱、离心机购自Thermo公司，电泳仪及凝胶成像系统购自Bio-Rad，流式细胞仪购自BD公司。

1.2 方法

神经肝细胞培养：成年C57/BL小鼠20只，其中雌性15只，雄性5只，体重20 g，10～12周龄，颗粒饲料室温23℃，湿度55%喂养，按雌雄比2∶1合笼交配，孕鼠分笼喂养。取孕14 d小鼠，以颈椎脱臼法处死，无菌下剪开皮肤和肌肉层，暴露子宫，将胎鼠转移至装有4℃Hanks液的培养皿中，于超净工作台中，剪开子宫，取胎鼠大脑皮层，在显微镜下剥离大脑皮层外膜。机械消化法制备单细胞悬液，取少数细胞悬液台盼蓝染色，计数活细胞比例，调整细胞浓度为1×106/mL，鉴定并置37℃及5%CO2条件下培养。

药物处理：取神经干细胞悬液孵育6 h，待完全贴壁后，随机分为5组，每组3孔，分别为异丙酚低、中、高浓度组（A1，A2，A3组），对照组（B组）及溶剂组（C组），A1，A2，A3组分别给予2.5，5.0，10.0μg/mL异丙酚，B组不作处理，C组给予脂肪乳替代异丙酚，于37℃及5%CO2条件下培养12，48，72 h。

四氮唑盐（MTT）法测定增殖活性［2］：收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度至1×106/mL个细胞。每孔加入MTT溶液10μL，继续培养4 h。以1 000 r/min的速率离心10min，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100μL，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光度。增殖抑制率=（1-试验组OD值/对照组OD值）×100%。

流式细胞术测定细胞凋亡情况：直接收集悬浮细胞到10mL的离心管中，每个样本有（1～5）×106/mL个细胞，以1 000 r/min的速率离心5 min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，500～1 000 r/min离心5min。用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。500～1000 r/min离心5min，沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测异硫氰酸荧光素（FITC）荧光，另一波长于560 nm的滤器检测磺化丙啶（PI），左上象限为死亡细胞，右上及右下象限为凋亡细胞。

Western Blot法检测相关蛋白：收集细胞，加200μL裂解液［50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.0，150 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），0.1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40），蛋白酶抑制剂］。4℃12 000 r/min离心15min，取上清液，采用Bradford法检测蛋白浓度；取上述制备的蛋白样品50μg上样到15%SDS-PAGE凝胶，电泳完毕后将蛋白电转至硝酸纤维素（NC）膜，用5%脱脂奶粉封闭，分别加一抗，37℃孵育2 h，经0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X线胶片定影，扫描后用IPP 6.0进行图像分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 细胞增殖情况

以MTT法对不同组别细胞增殖活性进行测定，结果显示，B组及C组细胞生长活跃，采用不同浓度的异丙酚处理12 h后细胞增殖率无显著性差异（P＞0.05），处理48，72 h后增殖抑制率呈现出浓度和时间依赖性，见图1。

图1 不同细胞增殖情况

2.2 细胞凋亡情况

细胞处理48 h后，采用流式细胞术对各组细胞凋亡情况进行分析。与B组相比，C组细胞凋亡率与死亡率无显著性差异（P＞0.05），A组凋亡率和死亡率显著升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表1。

表1 各组细胞凋亡情况（±s，%）

表1 各组细胞凋亡情况（±s，%）

注：与B组相比，*P＜0.05。

死亡率1.62±0.18 1.71±0.20 2.82±0.42*4.02±0.51*6.28±0.66*组别B组C组A1组A2组A3组凋亡率3.81±0.19 4.02±0.26 11.17±3.84*21.59±4.92*35.27±5.11*

2.3 W estern Blot法相关蛋白分析

采用Western Blot法对各组细胞中p38及CaMKⅡ表达水平进行分析。与B组相比，各组p38及CaMKⅡ的表达量无显著性差异（P＞0.05），而随着异丙酚处理浓度的提高，p-p38及p-CaMKⅡ的表达量显著升高（P＜0.05），见图2。

图2 异丙酚对各组细胞P38及CaMKⅡ表达的影响

3 讨论

异丙酚因起效快、苏醒迅速及完全的特性被广泛用于临床静脉麻醉［3］，单独使用异丙酚进行静脉麻醉可能会降低术后呕吐及眩晕的发生；此外，异丙酚的免疫调节、抗焦虑、促进一氧化氮（NO）合成［4］、抗氧化、抗血小板聚集［5］及神经保护作用［6］也被研究人员所发现。近年的研究显示，异丙酚能诱发神经元凋亡［7］，引起突触结构发育异常，损害学习和记忆能力。通过体外试验研究不同浓度异丙酚对神经干细胞的增殖和凋亡的影响及相关作用机制，可为临床麻醉用药的合理性和安全性提供试验基础。

异丙酚对细胞凋亡早期启动阶段的作用及关键靶点研究较少，异丙酚在短时间内能激活ERK信号通路，改变线粒体凋亡相关通路基因的转录水平。丝裂原信号激酶（MAPK）在细胞的凋亡中往往扮演着重要角色，MAPK家族中的细胞外信号激酶（ERK），p38及c-jun氨基端激酶（JNK）在化学物质和应激条件下活化，与细胞凋亡关系密切。活化的MAPK引起线粒体介导的细胞凋亡程序，伴随细胞色素C的释放及半胱天冬酶的激活。Ca2+是细胞内重要的细胞信号分子，各种刺激会导致细胞内的Ca2+浓度升高，与钙调蛋白（CaM）结合发挥多种生物学作用，包括迁移、增殖及信号转导，Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是Ca2+信号通路中重要的分子［8］，与Ca2+结合后发生自身磷酸化［9］，参与多种信号转导。多项研究表明，Ca2+-CaMKⅡ途径的激活会进一步激活转化生长因子β激活激酶（TAK1），激活MAPK家族的p38激酶［10-11］，进而应激活化激酶（JNK）诱导细胞凋亡［12］，CaMKⅡ可引起线粒体去极化，释放细胞色素C，激活半胱天冬酶介导的细胞凋亡。本研究中分析了不同剂量的异丙酚对神经干细胞凋亡的影响及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用，结果显示，不同浓度的异丙酚处理12 h后细胞增殖率无显著性差异，处理48 h及72 h后呈现出浓度和时间依赖性，表明高浓度的异丙酚能抑制神经干细胞的增殖，而随着异丙酚处理浓度的增加p38及CaMKⅡ的表达水平较对照组无显著性改变；但p38及CaMKⅡ的表达量显著升高，表明异丙酚通过促进p38及CaMKⅡ的磷酸化，激活CaMKⅡ-p38通路，在异丙酚诱导神经干细胞凋亡的过程中扮演重要角色。

综上所述，异丙酚作为临床常用的静脉麻醉药物，高于临床有效血药浓度处理神经干细胞会抑制细胞增殖，促进凋亡。Ca2+诱导的CaMKⅡ-p38通路在其诱导神经干细胞凋亡中有重要作用，可为临床麻醉用药的合理性和安全性提供试验基础。

［1］徐亚丰.异丙酚联合雷米芬太尼维持老年臂丛神经阻滞麻醉40例［J］.中国药业，2015，24（5）：64-65.

［2］利莉，廖淳杰，覃怡，等.不同剂量异丙酚麻醉对新生大鼠远期认知功能的影响［J］.中华麻醉学杂志，2012，32（10）：1 204-1 207.

［3］Tawfik HA，Mostafa M.Sevoflurane versus propofol sedation during periocular anesthetic injections in oculoplastic procedures：An open-label randomized comparison［J］.Saudi JOphthalmol，2015，29（2）：126-129.

［4］Wickley PJ，Shiga T，Murray PA，et al.Propofol decreases myofilament Ca2+sensitivity via a protein kinase C-，nitric oxide synthase-dependent pathway in diabetic cardiomyocytes［J］.Anesthesiology，2006，104（5）：978-987.

［5］陈杰，陶国才，毕敏，等.异丙酚麻醉下烧伤手术患者血小板聚集功能的变化［J］.重庆医学，2006，35（11）：1 010-1 011，1 016.

［6］邱小春，黄伟新.麻醉剂量异丙酚对缺血性脑损伤大鼠的神经保护作用研究［J］.辽宁医学杂志，2012，26（4）：175-177.

［7］Milanovic'D，Peši V，Popic'J，et al.Propofol anesthesia induces proapoptotic tumor necrosis factor-αand pro-nerve growth factor signaling and prosurvival Akt and XIAP expression in neonatal rat brain［J］.JNeurosci Res，2014，92（10）：1 362-1 373.

［8］Ni H，Sun Q，Tian T，et al.Prophylactic treatment with melatonin before recurrent neonatal seizures：Effects on long-term neurobehavioral changes and the underlying expression of metabolism-related genes in rat hippocampus and cerebral cortex［J］.Pharmacol Biochem Behav，2015，133：25-30.

［9］张秀娟，刘亚伟，王娟，等.TAT-p38（AF）融合肽的构建及其对紫外线诱导的p38 MAPK通路激活的抑制作用［J］.山东医药，2010，50（19）：19-21.

［10］Wang Y，Tu Q，Yan W，et al.CXC195 suppresses proliferation and inflammatory response in LPS-induced human hepatocellular carcinoma cells via regulating TLR4-MyD88-TAK1-mediated NF-κBand MAPK pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，456（1）：373-379.

［11］Xin X，Zhou L，Reyes CM，et al.APPL1 mediates adiponectinstimu lated p38 MAPK activation by scaffolding the TAKl-MKK3-p38 MAPK pathway［J］.Am JPhysiol EndocrinolMetab，2011，300（1）：E103-E110.

Role of CaMKⅡ-p38 Pathway in the Apoptosis of Propofol Induced Neural Stem Cell

Wang Hongmei
（Chongqing Institute of Tumor，Chongqing，China 400030）

Objective To analyze the effect of different concentrations of propofol on neural stem cell apoptosis and the role of CaMKⅡ-p38 pathway.Methods Rats embryonic neural stem cells and pregnant 14 d were selected and divided into low，medium and high concentrations of propofol 2.5，5.0 and 10.0μg/mL propofol，the control group（no treatment）and the solvent group（fat emulsion）and analyzed the cell proliferation and apoptosis.The expression of CaMKⅡand p38 was analyzed by Western Blot.Results The cell proliferation had no significant difference after 12 h of different concentrations of propofol（P＞0.05），48 h and 72 h after treatment showed concentration and time dependent；compared with the control group，the apoptosis rate and mortality of the solvent group had no significant difference（P＞0.05），while the apoptosis rate and mortality were significantly increased in different concentrations of propofol（P＜0.05），and showed a dosage-dependent manner；with the increase of propofol concentrations，P-P38 and P-CaMKⅡexpression were significantly increased（P＜0.05）.Conclusions Different concentrations of propofol can inhibit proliferation of neural stem cells，induce apoptosis；CaMKⅡ-p38 pathway has an important role on providing an experimental basis for the rational and safe clinical anesthesia medication.

propofol；neural stem cells；apoptosis；CaMKⅡ；p38

R962；R971+.1

A

1006-4931（2015）22-0073-03

王洪梅，大学本科，药师，研究方向为临床药学，（电话）023-65301592（电子信箱）31767834@qq.com。

2015-07-03）