黄柏药材中生物碱类多成分的含量测定

张庆明，张平，徐云燕，苏华

（中国人民解放军南京军区南京总医院制剂科，江苏南京210002）

黄柏药材中生物碱类多成分的含量测定

张庆明，张平，徐云燕，苏华

（中国人民解放军南京军区南京总医院制剂科，江苏南京210002）

目的建立同时测定黄柏药材生物碱类多成分含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法。方法色谱柱为Waters XBridge C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为0.1%磷酸水（含0.02mol/L磷酸二氢钠）-乙腈（3∶1）等度洗脱，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为345 nm。结果生物碱类成分进样量盐酸小檗碱在0.880 0～13.200 0μg（n=6），盐酸巴马汀在0.003 8～0.060 8μg（n=6），盐酸药根碱在0.003 2～0.051 2μg（n=6）范围内与峰面积线性关系良好；三者平均加样回收率分别为96.23%，98.32%，96.44%，RSD分别为0.38%，0.56%，1.15%（n=6）。结论该法能同时测定黄柏药材中小檗碱、巴马汀、药根碱生物碱类成分的含量，可有效控制黄柏药材的质量。

高效液相色谱法；黄柏；生物碱类；盐酸药根碱；盐酸巴马汀；盐酸小檗碱

黄柏为常用中药材，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，习称川黄柏，为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinese Schneid.的干燥根皮［1］。黄柏所含活性生物碱成分主要有小檗碱、药根碱、巴马汀［2-3］，但黄柏药材及含黄柏中药复方制剂的质量均仅以小檗碱的含量作为评价指标。由于小檗属多种植物中均富含上述成分，故上述方法难以有效控制黄柏药材的质量。为客观评价和控制黄柏的质量，本研究中建立了同时测定黄柏中小檗碱、巴马汀、药根碱生物碱类3种成分的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，现报道如下。

1 仪器与试药

2695型高效液相色谱仪，包括2998型二极管陈列检测器，Empower工作站（美国Waters公司）；LC-20A型液相色谱仪，包括Sartorius BT125D型；EPED超纯水系统（日本岛津公司）。盐酸小檗碱（批号为110713-200609）、盐酸药根碱（批号为110732-200506）、盐酸巴马汀（批号为0733-200005）对照品均购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，水为超纯去离子水，其余试剂均为分析纯；7批不同产地黄柏样品由江苏省中药研究院生药室采集，经鉴定为原植物为Phellodendron chinese Schneid.。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：0.1%磷酸水（含0.02mol/L磷酸二氢钠）-乙腈（3∶1），等度洗脱；柱温：30℃；检测波长：345 nm。色谱图见图1。

2.2 溶液制备

精密称取盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀对照品适量，加甲醇溶解并定容，分别制成含0.90 g/L盐酸小檗碱、0.20 g/L盐酸药根碱、0.15 g/L盐酸巴马汀对照品贮备液。取干燥黄柏样品粉末（过3号筛）约0.4 g，精密称定，置100mL容量瓶中，加入80mL 60%乙醇，超声处理45min，冷却，60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密移取盐酸药根碱、盐酸巴马汀对照品贮备液1～50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成盐酸药根碱含量为0.003 8 g/L、盐酸巴马汀为0.003 2 g/L的混合对照品溶液，摇匀静置，在拟订色谱条件下分别进样1，2，4，8，16，20μL，以峰面积积分值（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标制作标准曲线。取盐酸小檗碱贮备液，在拟订色谱条件下进样1，3，7，10，15，20μL，以峰面积积分值（Y）为纵坐标、进样量（X，mg）为横坐标制作标准曲线。得回归方程及线性范围见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 3种成分回归方程及线性范围（n=6）

精密度试验：分别精密移取盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀对照品贮备液2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置。在拟订色谱条件下进样8μL，重复6次。结果的RSD分别为0.30%，0.35%，0.45%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取5份同批次黄柏样品粉末0.4 g，精密称定，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件进样8μL测定。结果的RSD分别为1.50%，1.70%，1.83%（n=5），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，3，8，24 h时进样8μL测定。结果的RSD分别为1.51%，1.64%，0.53%（n=4），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取5份已知含量的同一批次黄柏样品约0.1，0.2，0.2 g，精密称定，分别精密加入盐酸小檗碱对照品贮备液4mL，盐酸药根碱对照品贮备液300μL，盐酸药根碱对照品贮备液150μL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样8μL测定，结果见表2。

2.4 样品含量测定

称取各批次样品0.4 g，精密称定，依法制备供试品溶液，分别精密吸取8μL，注入液相色谱仪，以外标法计算黄柏中3种成分含量，结果见表3。

表2 盐酸小檗碱、盐酸药根碱及盐酸巴马汀加样回收试验结果（n=6）

表3 不同产地黄柏中3种成分含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

提取溶剂的选择：考察了甲醇、乙腈（V/V）、60%乙醇3种提取溶剂的提取效果。峰面积测定结果表明，60%乙醇对小檗碱、巴马汀、药根碱的提取效果明显优于甲醇及乙腈，最终采用60%乙醇作为提取溶剂。

提取方法的选择：考察了超声提取、加热回流提取和索氏提取3种提取方法。结果超声提取45min的样品各峰面积均大于加热回流提取1，2，3 h的样品峰面积，而索氏回流提取8 h的提取效果并未明显高于超声提取，最终选择超声提取45min。

流动相条件的考察：在水相为纯水的条件下，各峰不能得到良好的分离且峰形拖尾严重，将水相条件调整为0.1%（V/V）磷酸溶液后，各峰峰形有明显改善，但分离效果仍不理想。在0.1%（V/V）磷酸溶液中加入磷酸二氢钠适量，配制成0.02mol/L的磷酸二氢钠缓冲溶液后，各峰分离度均大于1.5，达到分离要求。

方法学考察及7批黄柏样品中3种成分的含量测定结果表明，该法稳定、简便、实用性强，为黄柏药材的质量控制提供了较好的依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：214.

［2］肖培根.新编中药志［M］.北京：化学工业出版社，2002：664-670.

［3］李峰，贾彦竹.黄柏的临床药理作用［J］.中医药临床杂志，2004，16（2）：191.

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0082-02

张庆明，男，在读硕士研究生，助理工程师，执业药师，（电子信箱）zhangqingming025@163.com；苏华，女，硕士研究生，主管药师，执业药师，本文通讯作者，（电子信箱）suhuash@ sina.com.cn。

2014-12-29；

2015-05-30）