高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定保健食品和中成药中违法添加的10种降糖类西药

隋海山，王立娟，谢菲

（1.山东省潍坊市食品药品检验检测中心，山东潍坊261041；2.山东省潍坊市红十字中心血站，山东潍坊261041）

高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定保健食品和中成药中违法添加的10种降糖类西药

隋海山1，王立娟2，谢菲1

（1.山东省潍坊市食品药品检验检测中心，山东潍坊261041；2.山东省潍坊市红十字中心血站，山东潍坊261041）

目的建立高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法，测定保健食品和中成药中添加的10种降糖类西药。方法色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为0.01mol/L的乙酸铵水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱，进样量为10μL，DAD扫描范围为190～400 nm，检测波长为235 nm，流速为1.0 mL/min。通过比较样品峰与对照品峰的保留时间，DAD光谱、一级质谱、二级质谱图确定样品中是否添加了降糖类药物，并根据回归方程计算添加药物的准确含量。结果10种药物的分离度良好，回收率为95.50%～101.95%。结论该方法简便准确，灵敏度高，可作为保健品及中成药非法添加降糖类药物的测定方法。

保健品；非法添加；降糖药；高效液相色谱-二极管阵列检测器

2013年资质认定扩项工作中，用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法和高效液相色谱联合质谱（HPLCMS/MS）法都检出2批样品（保健食品和医院自制制剂）含盐酸苯乙双胍、格列本脲、马来酸罗格列酮，检出违法添加西药种类与文献［1］报道一致。笔者总结了10种降糖类药物的DAD图谱，以供保健食品和中成药中违法添加降糖药物监测工作参考。

1 仪器与试药

Agilent1260型液相色谱仪，Infinity 1260型DAD检测器；ST-16R型Thermo冷冻离心机；Synthesis A10型超纯水系统；XS-205DU型电子天平（德国梅特勒公司）；KQ-200KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）。盐酸苯乙双胍（批号为201203，纯度为99.7%）、格列本脲（批号为200404，纯度为100%）、盐酸二甲双胍（批号为201203，纯度为100%）、格列喹酮（批号为201002，纯度为99.37%）、格列吡嗪（批号为201203，纯度为99.5%）、盐酸吡格列酮（批号为201202，纯度为100%）、格列齐特（批号为201004，纯度为99.9%）、格列美脲（批号为201102，纯度为99.1%）、瑞格列奈（批号为201102，纯度为99.7%）、马来酸罗格列酮对照品（批号为200701，纯度为99.5%），均来自中国食品药品检定研究院；保健食品（糖安帕拉硒化VE胶囊，通化力神保健品公司，批号为20110106，规格为每粒300mg）；医院自制制剂（降糖胶囊，山东省临朐县糖尿病研究所，批号为20100912，规格为每粒0.5 g）；甲醇（默克公司）、乙酸钠均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件［2-4］

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：含0.01mol/L的乙酸铵水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～30 min，40%B；30～40 min，40%→60%B；40～60 min，60%B；60～70 min，60%→70%B；70～80 min，70%B；80～90min，70%→40%B；90～95min，40%B）；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；DAD扫描范围：190～400 nm；检测波长：235 nm。DAD图谱见图1。

2.1.2 溶液制备

准确称取含盐酸苯乙双胍、格列本脲、盐酸二甲双胍、格列喹酮、格列吡嗪、盐酸吡格列酮、格列齐特、格列美脲、瑞格列奈、马来酸罗格列酮各10.0mg，分别用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成质量浓度为1 g/L的贮备液，于4℃下保存，使用前用甲醇稀释，得对照品贮备液。分别准确吸取1.0mL各对照品贮备液置100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得混合标准溶液。取保健食品和医院自制制剂各20粒，倾出内容物，研碎，混匀，精密称取1次口服剂量的内容物，加甲醇25 mL超声处理20 min，静置，放冷，以8 000 r/min的速率离心15 min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

图1 高效液相色谱图

线性关系及检出限、定量限考察：取各对照品贮备液，准确配制系列质量浓度的混合标准溶液，重复进样，测定3次，以各物质峰面积平均值（Y）对被测组分的质量浓度（X，μg/mL）进行线性回归，得回归方程，见表1。以信噪比（S/N）3和10为标准，测得10个待测组分的检出限及定量限。

重复性试验：取同一批次样品6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，在优化的试验条件下测定峰面积。结果的RSD为0.8%～2.9%（n=6），表明该方法重复性好。

稳定性试验：取同一批次样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，在优化的试验条件下分别于0，2，4，6，8，10 h时测定峰面积。结果的RSD为0.9%～3.1%（n=6），表明供试品溶液在10 h内稳定。

表1 10种降糖类西药的线性关系检出限及定量限（n=3）

表2 样品含量测定结果（μg）

表3 质谱分析条件参数

2.1.4 样品含量测定

取不同批号的样品，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，在优化的试验条件下测定，计算样品含量。结果见表2。

2.2 质谱鉴定

2.2.1 质谱条件

离子源：电喷雾电离源；正离子模式检测；CAD（喷撞气）：4 psi；CUR（气帘气）25 psi；GS1（喷雾气）65 psi；GS2（辅助加热气）65 psi；IS（离子化电压）5 500 V；温度（TEM）：600℃；采用多反应监测（MRM）。参数见表3。经对比，样品中3种成分的质谱图与对照品质谱图一致。

表4 10种化合物加样回收试验结果（n=6）

2.2.2 加样回收试验

各取3份（按中、高、低量级加入）不含降糖类药物的1次剂量空白基质，各加入2.1.2项下的混合标准溶液，每份作2次平行试验。结果见表4。

3 讨论

参照国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件2009029的方法进行了HPLC法的检验，原标准将盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍和其余8种物质分开，用不同的HPLC法检验，本试验中同时检测10种成分，提高了效率［5-8］。

梯度洗脱程序较原标准延长30 min，75 min时洗脱出较多杂质，10种成分均较好分离。故选择洗脱时间为75 min。

本试验中，DAD检测器检测样品检出了盐酸苯乙双胍、格列本脲、罗格列酮3种违禁成分，与对照品的紫外光谱和二级质谱基本一致，保留时间也一致。

本试验中建立了降糖类药物的DAD标准图库，样品中未知峰的DAD图谱通过自动匹配功能就能提高非法添加物的靶向性。

［1］肖树雄，李杨杰.由降糖中成药和保健食品检验情况探索非法添加化学成分的系统快筛思路［J］.药物分析杂志，2011，31（2）：418-422.

［2］刘起中，李慧义，杭太俊.中药降糖制剂中非法掺入的化学降糖药物成分的检测［J］.中国现代应用药学杂志，2008，25（1）：61-63.

［3］罗干明.降糖类中药及保健食品中掺入的盐酸苯乙双胍检测［J］.中国药业，2009，18（4）：31.

［4］张妤琳，曹玲.降糖保健食品中非法添加盐酸苯乙双胍和格列本脲的检测［J］.药学与临床研究，2007，15（5）：423-426.

［5］张吉吉，高青，余倩.中药制剂及保健品中违禁添加9种化学降糖药的HPLC-MS/MS定性检测［J］.中国医药工业杂志，2007，38（1）：39-43.

［6］刘惠军，付萍萍，刘敏芳，等.降糖类中药制剂中添加化学药品的检测方法研究［J］.中国现代应用药学，2008，25（6）：525-527.

［7］潘炜，郑顺利，毛希琴，等.LC-MS/MS测定中成药制剂中12种口服降糖药［J］.药物分析杂志，2009，29（4）：569-574.

［8］董银芬.液相色谱-质谱检测中药及相关制品中非法添加化学药物的应用进展［J］.中国药物与临床，2012，12（3）：358-359.

Detection of 10 Kinds of Antidiabetics Illegally Added in Traditional Chinese Medicines and Health Care Products by HPLC-DAD

Sui Haishan1，Wang Lijuan2，Xie Fei1
（1.Weifang Center for Food and Drug Conrtol，Weifang，Shandong，China，261041；2.Weifang Red Cross Blood Center，Weifang，Shandong，China，261041）

Objective To establish an HPLC-DAD method for the determination of 10 antidiabetic agents illegally added in traditional Chinese medicines and health care products.Methods The analytes were separated on an Agilent ZORBAX SB-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with 0.01 mol/L ammonium acetate solution and methanol as mobile phase by gradient elution.DAD scanning range was 190-400 nm，detection wavelength of 235 nm，flow rate of 1.0 mL/min.The retention time，DAD spectrum，primary mass spectrometry and peak area obtained were used to identify and determine the contents of antidiabetic in traditional Chinese medicines and health care products.Results A good resolution was obtained for the 10 kinds of chemical drugs under the HPLC conditions.The standard addition recoveries were in the range of 95.50%-101.95%.Conclusion The method is simple，rapid，accurate and highly sensitive，which can be used for the determination of illegal contents in the traditional Chinese medicines and health care products.

healthy care products；added illegally；antidiabetics；HPLC-DAD

R927.2；R977.1+5；R954

A

1006-4931（2015）22-0110-03

2014-10-17；

2015-07-13）