溶藻弧菌生物被膜形成能力及特性分析

贾玲华，宁喜斌，张徐晶（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

溶藻弧菌生物被膜形成能力及特性分析

贾玲华，宁喜斌*，张徐晶
（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

采用改良的微孔板法对114株溶藻弧菌的生物被膜形成能力强弱进行测定，挑选其中1株最强被膜形成能力的菌株进行不同环境因素下的特性分析，并用荧光显微镜观察被膜形成情况。结果表明：测定菌株中有112株具有被膜形成能力（98.25%），其中具有强或中等强度被膜形成能力的有65株（57.02%）。28℃条件下，溶藻弧菌在含3% NaCl、pH为6.00～8.00的TSB中培养16 h时生物被膜的形成量最大；而添加一定浓度的Mn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+后则不同程度地抑制被膜的形成，并且抑制效果依次降低；菌株在接触亲水性表面（不锈钢和玻璃）时被膜形成量显著高于疏水性表面（聚苯乙烯）（p＜0.05），且在不锈钢表面形成量最大；荧光显微镜下的观察结果与微孔板法一致。不同溶藻弧菌菌株生物被膜的形成能力具有很大差异且受不同环境因素的影响。研究结果可以为有效控制溶藻弧菌被膜形成提供理论支持。

溶藻弧菌，生物被膜，环境因素，特性

细菌极易黏附于活性或惰性物体表面，并在代谢过程中分泌胞外基质（如多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等）以特定方式将其自身包裹其中组成结构性细菌群落［1-2］，即形成生物被膜（Biofilm，BF）。被膜的形成会大大增强细菌对不利环境因素（如冷热、消毒剂等）的抵抗能力［3］，导致食品加工设备及接触面上的致病菌不能完全杀灭，残存在膜内的细菌又会游离出来再次大量繁殖，造成食品工业环境中致病菌的持续、反复感染，给食品生产带来严重的安全隐患。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，Va）隶属弧菌科弧菌属，是一种嗜盐性、革兰氏阴性弧菌，其广泛分布在全球各地的海水以及河口水域［4-5］，是导致人类、水产动物细菌性疾病的重要条件致病菌之一［6］。近年来研究发现其与副溶血性弧菌相似，也是沿海地区食物中常见的引发腹泻病的致病菌［7-10］，在水产品处理不充分或生食时，溶藻弧菌的食源性感染很有可能以被膜形式存在［11］。目前，生物被膜在医学领域已经成为热点，但在食品加工领域还比较少，尤其国内外关于影响溶藻弧菌生物被膜形成因素的研究报道很少。因此，对溶藻弧菌生物被膜形成情况的研究显得尤为重要。

本文以114株不同来源分离的溶藻弧菌菌株为研究对象，分析了该菌生物被膜的形成能力，并选取1株最强被膜形成能力的菌株进行不同环境因素下对被膜形成影响的初步探讨，旨在为控制溶藻弧菌生物被膜的形成提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

114株溶藻弧菌分离菌株（24株中洋养殖池水样，19株五四农场养殖池水样，36株东海水样，17株中洋河豚鱼表皮样，18株中洋河豚鱼肠道样） 实验室-80℃保存；硫柠胆蔗琼脂培养基（TCBS）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB） 上海市浦东新区疾病预防控制中心；甲醇、结晶紫、NaCl、氯化钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰国药集团化学试剂有限公司，分析纯；SYBR GreenⅠ上海索莱宝生物科技有限公司。

corning24孔板、96孔板国药集团化学试剂有限公司；台式pH精密测试仪德国WTW；荧光显微镜卡尔蔡司有限公司；CORONASH-1000型酶标仪广州济恒医药科技有限公司；不锈钢圆片（直径14 mm）、玻璃圆片（直径14 mm） 江苏海门三和实验器材总厂。

1.2实验方法

1.2.1菌液的准备溶藻弧菌菌株在3%NaCl的TSB中37℃120 r/min摇床振荡培养7～8 h后，用无菌生理盐水调节菌液浓度为0.5麦氏浓度（约108cfu/mL），备用。

1.2.2生物被膜的培养及测定在参考Srdjan等［12］微孔板法基础上进行适当改良：无菌条件下，于96孔板中每孔加入198 μL 3%NaCl TSB培养液后转接2 μL备用菌液，用排枪吹打进行混匀，每组重复8孔，平行3次，并以无菌TSB培养液作阴性对照。37℃静置培养16 h后移除孔中培养液，加入250 μL生理盐水清洗3次，加入200 μL 99%甲醇固定15 min，清空，自然晾干后加入200 μL 1%的结晶紫染液染色10～15 min，用无菌水缓缓冲洗掉未结合染液，待室温干燥后加入250 μL 95%乙醇，等到结晶紫完全溶解后用酶标仪测定OD590nm，比较不同溶藻弧菌菌株的成膜情况。

参照Christensen等［13］的标准可将各菌株被膜形成强弱程度按其OD值进行分类：将阴性对照的平均值加上其3倍标准差定义为界定值（ODC），其中OD≤ODC为无粘附（－），ODC＜OD≤2ODC为弱粘附（+），2ODC＜OD≤4ODC为中等粘附（++），OD＞4ODC为强粘附（+++）。

1.2.3不同环境因素对生物被膜形成的影响在所有的114株溶藻弧菌分离菌中，挑取被膜形成能力最强的菌株VaP40进行不同环境因素下生物被膜形成情况的探索。

1.2.3.1不同培养温度对被膜形成趋势的影响选择不同的培养时间（4、8、12、16、20、24、36、48、72 h），按照1.2.2的方法分别在不同温度下（4、28、37、42℃）测定生物被膜形成趋势的变化。

1.2.3.2NaCl浓度对被膜形成的影响分别将不同含量（0.00%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、6.00%、7.00%、8.00%）的NaCl加入TSB培养液，按照方法1.2.2进行实验，比较不同NaCl浓度下生物被膜的形成情况。

1.2.3.3金属阳离子对被膜形成的影响分别配制不同浓度Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+（0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%）的TSB培养液，按照方法1.2.2进行实验，比较不同离子对被膜形成的影响。

1.2.3.4起始pH对被膜形成的影响分别配制不同pH（3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00）的TSB培养液，按照1.2.2的方法测定，比较不同pH条件下被膜形成情况。

1.2.4不同接触材料表面对被膜形成能力的影响将菌液与3%NaCl TSB培养液1∶100混匀后，每孔1 mL分别加入底部放有不同材料（经处理灭菌后的不锈钢圆片、玻璃圆片）的24孔板及底部自身为聚苯乙烯（PS）材料的24孔板中，每组4个重复，平行3次。28℃培养16 h后移除培养物，用生理盐水清洗3次，加入2 mL 99%甲醇固定15 min，清空，室温晾干后用2 mL 1%结晶紫染液染色15 min，清洗未结合染液，室温干燥后每孔加入2 mL 95%乙醇，待结晶紫完全溶解后吸取250 μL于96孔板，用酶标仪测定OD590nm。

1.2.5荧光显微镜观察被膜的形成情况从1.2.3.2的实验结果中，选取被膜生长较好（3%）与较差（8%）的NaCl浓度，在其条件下用荧光显微镜观察被膜形成情况，并对微孔板法结果进行验证：分别在含3% NaCl及8%NaCl TSB培养液条件下，在装有玻璃片的24孔板中进行被膜培养。28℃培养16 h后取出，移除培养物并用生理盐水清洗3次，4℃条件下用4%的戊二醛固定2 h后用生理盐水清洗3次，用SYBR GreenⅠ（1∶100000）避光染色30 min。再用生理盐水清洗3次后制成载玻片置于荧光显微镜下观察VaP40的被膜形成情况，并对微孔板法的结果进行验证。

1.3数据分析

实验数据的统计分析采用Excel、SPASS、Origin等软件。

2　结果与分析

2.1生物被膜形成能力的测定

用改良微孔板法检测114株溶藻弧菌分离菌株的被膜形成能力，结果显示（表1）：几乎所有的菌株都能形成生物被膜，但不同菌株之间被膜形成能力不同，其中具有强被膜形成能力的有12株（10.53%），中等强度被膜形成能力的共53株（47.37%）；47株（38.60%）被膜形成能力较弱。其中菌株VaP40的成膜能力（OD590nm=2.941±0.036）显著高于其他菌株（p＜0.01）。

表1　溶藻弧菌生物被膜测定结果Table 1　Results of biofilm formation of Vibrio alginolyticus

表2　不同来源溶藻弧菌生物被膜形成能力比较（%）Table 2　Comparison of biofilm formation by Vibrio alginolyticus from different source（%）

从表2中可看出，不同来源分离菌株的被膜形成呈现不同的强弱分布。从中洋河豚鱼表皮分离的菌株产生物被膜能力强或中强的数目比例明显高于其他来源（70.58%），而仅有的2株无被膜形成能力的菌株来源于中洋养殖池水样。

2.2不同培养温度对被膜形成趋势的影响

在28、37及42℃的条件下，培养初期OD590nm值明显呈上升趋势，生物被膜的量逐渐增多，到16 h时达到峰值，而在24 h之后迅速下降。结果还发现4℃条件下，菌株P40在不同的时间点下OD590nm值均很小，基本没有生物被膜的形成，而在28℃时生物被膜的形成量最大（图1）。

图1　培养温度对VaP40被膜形成趋势的影响Fig.1　Effect of temperature on the biofilm-forming tendency of VaP40

2.3NaCl浓度对被膜形成的影响

在一定范围内，NaCl浓度显著影响着溶藻弧菌被膜的形成。菌株VaP40在浓度为1%～6%时均能大量形成生物被膜，且浓度为3%时达到峰值，与2.5%浓度时的形成量差异不显著，但极显著高于其余浓度条件下的OD590nm测定值（p＜0.01）；当浓度高于6%时，被膜形成量迅速降低（图2）。

图2　NaCl浓度对VaP40被膜形成的影响Fig.2　Effect of concentration of NaCl on the biofilm formation of VaP40

2.4Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+对被膜形成的影响

当添加Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+四种不同金属离子后，生物被膜的形成量都不同程度的在降低。当添加浓度为0.25%的Cu2+、Mn2+后生物被膜量极显著降低（p＜0.01），到浓度为0.25%～1.5%时OD590nm值达到基本稳定；而当添加0.25%～1.5%的Ca2+、Mg2+后OD590nm值也均逐渐减小，但其抑制效果均没有Cu2+、Mn2+高，其中Mg2+抑制效果最低，Mn2+效果最好（图3）。

图3　Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+对VaP40被膜形成的影响Fig.3　Effect of Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+on the biofilm formation of VaP40

2.5起始pH对被膜形成的影响

溶藻弧菌在起始pH为3.00～5.00时，OD590nm值很低，基本不形成生物被膜或形成量很低，pH在6.00～9.00时，有很强的被膜形成能力，其中pH6.00～8.00之间无显著差异，但均极显著高于其余pH条件下的测定值（p＜0.01）；随后被膜形成量随着pH增加而降低，到pH为12.00时基本无被膜形成能力（图4）。

2.6不同接触材料表面对被膜形成能力的影响

溶藻弧菌在聚苯乙烯（PS）、不锈钢片及玻璃片表面均可以形成明显的生物被膜，但其被膜形成能力不同，图中结果发现生物被膜在亲水性表面（玻璃和不锈钢）粘附程度均显著强于疏水性表面（PS）（p＜0.05），且当接触不锈钢片时测定的OD590nm最大（图5）。

图4　不同pH对VaP40被膜形成的影响Fig.4　Effect of Various pH on the biofilm formation of VaP40

图5　不同材料表面对VaP40被膜形成的影响Fig.5　Effect of different contact surfaces on the biofilm formation of VaP40

2.7荧光显微镜观察生物被膜

在3%NaCl条件下，菌株P40呈现了多细胞聚集的生物被膜结构，并大面积的覆盖了材料表面，荧光强度较强。而在8%NaCl条件细胞分布比较稀少，荧光强度较弱。因此，荧光显微镜的观察明显可以看出，在3%NaCl条件下有明显的被膜形成，而8%NaCl条件下被膜的形成量很少。该方法的观察结果也与微孔板法所得的结果相一致（图6）。

图6　VaP40生物被膜的荧光显微镜图（400×）Fig.6　The fluorescence microscope images of biofilm of VaP40（400×）

3　讨论

研究结果发现溶藻弧菌易形成生物被膜，这可能是因为其广泛存在于水产品及海域环境，有较强适应环境的生存能力；且不同来源不同菌株之间被膜的形成能力具有很大的差异性，这很大原因是由于生物被膜的形成是由多种机制共同调节的，因而对不同地域菌株进行研究很有必要。

生物被膜的形成过程分为起初的粘附、逐渐成熟再到衰老的阶段［14］。本实验结果发现溶藻弧菌也大致经历了这几个阶段：在0～8 h时为起初的粘附形成阶段，到16 h后达到成熟阶段，20 h之后开始进入衰老阶段。这一研究趋势与姚刚等［15］对溶藻弧菌生物被膜的结果基本一致。

研究发现，溶藻弧菌在28～42℃均有很好的被膜形成能力，而在低温4℃时形成量很低，这与起初菌体在低温条件生长迟缓有很大关系。而高温下良好的被膜形成能力也很有可能是溶藻弧菌在夏季大量引发疾病的重要原因之一。据报道Na+可以驱动细菌鞭毛的运动，进而促进被膜的形成［16］，本实验结果也发现当NaCl含量在1%～6%时溶藻弧菌能很好的形成生物被膜。而当不添加盐或盐含量过高时，溶藻弧菌很难生长，故而基本不形成生物被膜，也与本次结果相符。

研究结果显示溶藻弧菌在中性偏碱的条件下被膜的形成量更多，而酸性或强碱性条件时会受到抑制，这也与溶藻弧菌适宜生长在pH为7.5～8.6的天然海水中有很大关系。

本实验显示Ca2+抑制溶藻弧菌被膜形成，主要原因可能是Ca2+对溶藻弧菌菌体有一定损伤作用，而Cu2+、Mn2+的抑制作用则很可能是因为在添加这些金属离子之后培养液具有亲水性使生物有机体分散生长［17］，从而减少了生物被膜的形成。

许多材料（如玻璃、不锈钢、PS等）都是食品加工或包装的常用材料。Chavant等［18］发现，细菌不论是在亲水性的玻璃和不锈钢上还是疏水性的PS上都可形成被膜，并且亲水性材料表面更易形成，本次实验结果也与该研究发现相一致。

总之，细菌被膜的形成过程很复杂，涉及到细菌本身特性、培养环境（温度、pH、渗透压等）和细菌粘附表面特性（疏水性等）等多种不同因素［19］，细菌所在的生存环境对被膜的形成情况有着很大的影响。对不同环境条件下溶藻弧菌的被膜形成特性的研究，能够为食品环境中生物被膜的有效控制提供理论支持。

4　结论

改良微孔板法对114株溶藻弧菌分离菌株生物被膜形成能力进行测定后结果显示有112株有生物被膜形成能力，且不同菌株生物被膜的形成能力具有很大差异；溶藻弧菌被膜的形成受环境因素的影响，研究表明于28℃条件下，溶藻弧菌在含3%NaCl、pH为6.00～8.00的TSB中培养16 h时生物被膜的形成量最大；当添加一定浓度的Mn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+后则不同程度地抑制被膜的形成，并且抑制效果依次降低；菌株在接触亲水性表面（不锈钢和玻璃）时被膜形成量显著高于疏水性表面（聚苯乙烯）（p＜0.05），且在不锈钢表面形成量最大。

［1］Hall-Stoodley L，Costerton J W and Stoodley P.Bacterial bioflims from the natural environment to infections diseases［J］. Nature Reviews Microbiology，2004，2（2）：95-108.

［2］Costerton J W，Stewart P S，Greenberg E P.Bacterial biofilms：a common cause of persistent infections［J］.Science，1999，284（5418）：1318-1322.

［3］戚韩英，汪文斌，郑昱，等.生物膜形成机理及影响因素探究［J］.微生物学通报，2013，40（4）：677-685.

［4］蒋学兵，马聪，郭建巍，等.中国海域海洋细菌的分离与鉴定方法研究［J］.解放军医学杂志，2009（7）：898-900.

［5］韩善桥，虞积耀，姜涛，等.海水中致病性弧菌分离及抗菌药物敏感性分析［J］.中国抗生素杂志，2008，33（4）：239-241.［6］Amel B，Amine B，Kamel C，et al.Survival of Vibrio alginolyticus in seawater and retention of virulence of its starved cells［J］.Marine Environment Research，2007（64）：469-478.

［7］Larsen J L，Farid A F，Dalsgaard I.Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus in marine and estuarine bathing areas in Danish coast［J］.Zentralbl Bakteriol MikrobiolHyg B，1981，173（5）：338-345.

［8］封会茹，游京蓉，刘玉堂，等.溶藻弧菌引起暴发型食物中毒的病原学研究［J］.中国食品卫生杂志，2003（4）：331-334.

［9］侯霄煜.由溶藻弧菌引起的一起食物中毒［J］.中国卫生检验杂志，2005（9）：1123

［10］龚玲芬，郁祝新.副溶血弧菌和溶藻弧菌混合污染引起食物中毒的调查［J］.职业与健康，2008（4）：343-344.

［11］丁文艳，宁喜斌，李玉婷，等.不同副溶血性弧菌菌株成膜能力及成膜影响因子的研究［J］.食品工业科技，2014（23）：163-167.

［12］Srdjan S，Dragana V，Ivana D，et al.A modified microtiterplate test for quantification of staphylococcal biofilm formation［J］. Journal of Microbiological Methods，2000（40）：175-179.

［13］Christensen G D，Simpson W A，Younger J J，et al. Adherence ofcoagulase-negative staphylococci to plastic tissue cultureplates：aquantitativemodelfortheadherenceof staphylococci to medical devices［J］.J Clin Microbiol，1985（22）：996-1006.

［14］邓旗，孙力军，王雅玲，等.环境条件对腐败希瓦氏菌生物被膜形成能力的影响［J］.中国食品学报，2013（10）：43-50.

［15］姚刚，覃映雪，邹文政，等.致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究［J］.水产科学，2012（2）：73-78.

［16］Knobloch J K，Bartscht K，Sabottke A，et al.Biofilm formation by Staphylococcus epidermidis depends on functional RsbU，an activator of the sigB operon：differential activation mechanisms due to ethanol and salt stress［J］.Journal of Bacteriology，2001，183（8）：2624-2633.

［17］渠宏雁，孟良玉，刘锦峰，等.副溶血性弧菌生物被膜的形成与优化［J］.中国食品学报，2013（9）：56-61.

［18］Chavant P，Martinie B，Meylheuc T，et al.Listeria monocytogenes LO28：surface physicochemical properties and ability to form biofilms at different temperatures and growth phases［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（2）：728-737.

［19］Moltz A G.Formation of biofilms by Listeria monocytogenes under various growth conditions［J］.Journal of Food Protection，2005，68（1）：92-97.

Characterization and biofilm forming-ability of Vibrio alginolyticus

JIA Ling-hua，NING Xi-bin*，ZHANG Xu-jing
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China）

Modified microtiter-plate test was used to investigate the biofilm formation of 114 Vibrio alginolyticus strains.The strongest biofilm formation strain was selected for biofilm characteristics study under various environmental factors.Further，the biofilm formation was observed by using fluorescence microscopy.The results showed that among all the tested strains，112（98.25%）had biofilm formation ability，and 65（57.02%）were at the strong or moderate level.V.alginolyticus formed strong biofilm in pH6.00～8.00 TSB with 3%NaCl at 28℃for 16 h.The ability of biofilm formation was inhibited by adding a certain concentration of Cu2+，Mn2+，Ca2+，Mg2+.It’s also found that the bacteria adhered to hydrophilic surfaces（stainless steel and glass）better than to hydrophobic ones（polystyrene），and adhered best to stainless steel sheet.The fluorescence microscope observation was consistent with the modified microtiter-plate results.It concluded that V.Alginolyticus biofilm forming-ability was affected by various environmental factors with diversity among different strains.The results provided a theoretical support for the effective control of V.Alginolyticus biofilm formation.

Vibrio alginolyticus；biofilm；environmental factors；characteristic

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.034

2015－01－30

贾玲华（1991-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：jialinghua123@163.com。

宁喜斌（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品安全、微生物学，E-mail：xbning@shou.edu.cn。

上海市科委工程中心建设（11DZ2280300）。