银屑病患者皮肤中T细胞与黑素细胞的检测及临床意义

栾超 陈浩 杨永红 姜祎群 刘毅 陈敏 王宝玺

·论著·

银屑病患者皮肤中T细胞与黑素细胞的检测及临床意义

栾超 陈浩 杨永红 姜祎群 刘毅 陈敏 王宝玺

目的 研究银屑病患者皮肤中CD4+和CD8+T细胞与黑素细胞的关系和临床意义。方法 取29例进行期银屑病患者皮损和非皮损、5例消退期患者皮损和非皮损及6例健康人皮肤。免疫组化检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量和分布，并对比基底层黑素细胞和色素颗粒情况。采用SPSS18.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用最小显著差异法（LSD），相关性分析采用Pearson检验。结果 银屑病患者皮损中每个高倍（×200）视野CD4+T细胞平均数（表皮5.29±4.66，真皮77.50±43.66）明显高于非皮损（表皮为0，真皮9.67±7.73），皮损与非皮损比较，均P＜0.05；而CD8+T细胞的数量（表皮7.83±6.27，真皮46.08±34.26）亦明显高于非皮损（表皮0.71±1.20，真皮5.54±4.43），皮损与非皮损比较，均P＜0.05。与健康对照皮肤相比，银屑病患者皮损中CD4+T细胞和CD8+T细胞均明显增多，差异有统计学意义（均P＜0.05）。银屑病皮损处基底层黑素细胞数量（103.45±16.96）明显高于非皮损（43.62±14.20，P＜0.05）及健康人皮肤（P＜0.05），但色素颗粒阳性细胞比例（7.45%±3.86%）明显低于非皮损（43.10%±14.91%，P＜0.05）及健康人皮肤（P＜0.05）。非皮损处CD8+T细胞、CD4+T细胞、黑素细胞数量及色素颗粒阳性细胞比例与健康人比较差异均无统计学意义。消退期皮损黑素细胞数量高于消退后白斑（P＜0.05），色素颗粒阳性细胞比例略低于消退后白斑，但差异无统计学意义；与健康人比较，消退期皮损黑素细胞数量高，而色素颗粒阳性细胞比例低，均有统计学差异（均P＜0.05），消退后白斑的黑素细胞数量与健康人比较差异无统计学意义，而色素颗粒阳性细胞比例降低（P＜0.05）。进行期患者皮损中CD4+、CD8+T细胞数与黑素细胞数及色素颗粒阳性细胞比例均无相关性（均P＞0.05），而非皮损中CD4+、CD8+T细胞数与黑素细胞数呈正相关（r值分别为0.46和0.56，均P＜0.05），但与色素颗粒阳性细胞比例无明显相关性（P＞0.05）。结论 在银屑病进行期皮损中，CD4+T细胞和CD8+T细胞明显增多，基底层黑素细胞数量增加，但色素颗粒明显减少；皮损消退后，黑素细胞数量及色素颗粒逐渐接近健康人水平。

银屑病；T淋巴细胞；黑素细胞；CD8阳性T淋巴细胞；CD4阳性T淋巴细胞

银屑病是具有遗传背景的T细胞介导的慢性炎症性疾病，严重时累及关节和内脏器官，易并发代谢综合征和心脏疾病。临床上发现患者皮损消退后往往会留下色素减退斑，但对其机制并不清楚。以往研究［1-3］证实，一些神经相关因子参与银屑病的发病机制。来源于神经嵴的黑素细胞在该病的发病机制中起何作用，有关研究较少。我们研究银屑病患者皮损、非皮损和消退后皮损中T细胞与黑素细胞的关系，分析其临床意义。

病例和方法

一、病例资料

34例斑块状银屑病患者来源于2013年9月至2014年1月中国医学科学院皮肤病医院门诊患者，经临床和（或）组织病理诊断为银屑病，男21例，女13例，年龄 19～56（30.9±11.2）岁，病程 1个月至20年，银屑病皮损面积与严重程度指数（PASI）评分3.8～46。皮肤钻孔采集同一患者皮损和非皮损组织（均取自背部），其中5例患者取消退期皮损（原有皮损缩小变平，炎症浸润消退，鳞屑减少，周围出现浅色晕）［4］及消退后白斑（皮损消退后遗留暂时性色素减退斑）［4］（均取自背部）。6例健康人对照皮肤来源于我院皮肤外科整形手术多余的正常皮肤（取自背部），其中男 5例，女 1例，年龄 19～46（32.2±8.6）岁。患者和健康对照组性别、年龄比较差异无统计学意义。本研究经本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

二、试剂

兔抗人CD4和CD8单克隆抗体均产自沙特阿拉伯Abcam公司，分别按1∶250和1∶500稀释。枸橼酸抗原修复缓冲液、内源性过氧化氢酶抑制剂、非免疫动物血清（羊）、辣根过氧化物酶（HRP）标记抗羊鼠IgG和抗兔IgG、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、苏木素和中性树胶均产自福州迈新生物技术有限公司。

三、方法

1.组织病理检查：在躯干皮损处按常规钻孔取直径约5 mm皮肤标本，经固定、脱水、石蜡包埋、连续切片厚 5 μm，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察皮肤基底层黑素细胞和色素颗粒阳性细胞数量。

2.免疫组化：将组织制成蜡块后连续切成5 μm薄片，置于多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上；在孵箱60℃烤片2 h，二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；用枸橼酸缓冲液高压3 min进行抗原修复，PBS清洗后加过氧化氢酶抑制剂孵育10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，非免疫羊血清孵育10 min，除去血清后滴加适当稀释的兔抗人CD4或CD8单克隆抗体（一抗），空白对照组加PBS代替，4℃孵育过夜；PBS清洗后滴加HRP标记的抗兔IgG（二抗），孵育10mim后清洗，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化后中性树胶封片。所有切片均在同一质控条件下进行，设阳性和阴性对照。

3.结果判定：CD4阳性表达定位于细胞膜和胞质，CD8阳性表达定位于细胞膜，结果均为黄色或棕黄色颗粒，黑素细胞为基底层有黄褐色帽状结构细胞。计算5个显微镜高倍视野（×200）下的阳性表达T细胞平均个数、黑素细胞平均数及黑素阳性细胞在表皮细胞中所占比例。

4.数据处理：采用SPSS18.0软件进行统计分析，计量数据采用±s，结果行方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用最小显著差异法（LSD）。相关性分析采用Pearson检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 银屑病皮损（1A）、非皮损（1B）及健康对照皮肤（1C）CD4染色结果（×200） 银屑病皮损染色阳性细胞数明显多于非皮损和健康对照皮肤

图2 银屑病皮损（2A）、非皮损（2B）及健康对照组皮肤（2C）的CD8染色结果（×200） 银屑病皮损染色阳性细胞数明显多于非皮损和健康对照皮肤

图3 银屑病皮损（3A，HE×100）、非皮损（3B，HE×200）及健康对照皮肤（3C，免疫组化×200）的基底层黑素细胞及色素颗粒阳性细胞情况

结 果

一、银屑病患者进行期免疫组化结果

银屑病患者皮损中CD4+T细胞及CD8+T细胞分布广泛，表皮、真皮均有分布，而非皮损及健康人皮肤中则主要分布于真皮。患者皮损基底层黑素细胞数量明显多于非皮损及健康人皮肤，但色素颗粒阳性细胞比例却明显低于非皮损及健康人皮肤。见图1~3。进行期银屑病患者皮损表皮及真皮中CD4+T细胞的数量均较非皮损明显增多（均P＜0.05），CD8+T细胞亦较非皮损显著增多（均P＜0.05）。皮损基底层黑素细胞数量较非皮损明显增多（P＜0.05），但色素颗粒阳性细胞比例却明显低于非皮损（P＜0.05）。进行期银屑病患者皮损与健康对照组比较，表皮、真皮中CD4+T细胞、CD8+T细胞、黑素细胞均明显增多（均P＜0.05），但是色素颗粒阳性细胞比例明显降低（P＜0.05）；而非皮损组与健康对照组差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1、2。

表1 银屑病患者皮肤每高倍视野（×200）中CD4+、CD8+T细胞数（±s）

表1 银屑病患者皮肤每高倍视野（×200）中CD4+、CD8+T细胞数（±s）

注：a：与非皮损组比较，P ＜ 0.05；b：与健康人对照组比较，P ＜ 0.05

组别 例数银屑病皮损组 24 5.29±4.66ab 77.50±43.66ab 7.83±6.27ab 46.08±34.26ab银屑病非皮损组 24 0 9.67±7.73 0.71±1.20 5.54±4.43健康人对照组 6 0 13.00±8.60 0 15.17±5.49 F值 25.08 32.92 30.04 23.97 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 CD4+T细胞表皮 真皮CD8+T细胞表皮 真皮

表2 银屑病患者皮肤中黑素细胞数量及色素颗粒阳性细胞所占比例（±s）

表2 银屑病患者皮肤中黑素细胞数量及色素颗粒阳性细胞所占比例（±s）

注：a：与银屑病非皮损组比较，P＜0.05；b：与健康人对照组比较，P＜0.05；c：与消退后白斑组比较，P＜0.05

组别 例数 基底层黑素细胞数色素颗粒阳性细胞比例（%）银屑病皮损组 29 103.45±16.96ab 7.45±3.86ab银屑病非皮损组 29 43.62±14.20 43.10±14.91消退期银屑病皮损组 5 80.00±21.21bc 21.00±11.40bc银屑病皮损消退后白斑组 5 48.00±8.37 32.00±4.47b健康人对照组 6 43.33±14.02 54.17±29.40 F值 61.54 34.76 P值 ＜0.05 ＜0.05

二、银屑病患者消退期皮损黑素细胞及色素颗粒阳性细胞比例

皮损消退后白斑较消退期皮损黑素细胞数量减少（P＜0.05），色素颗粒阳性细胞比例则增加（P＜0.05）。而消退后白斑与健康人对照组皮肤比较，黑素细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05），色素颗粒阳性细胞比例减少（P＜0.05）。见表2。

三、银屑病患者CD4+T细胞、CD8+T细胞与黑素细胞相关性

进行期患者皮损中CD4+T细胞与黑素细胞数及色素颗粒阳性细胞比例（r值分别为0.32、0.05）及CD8+T细胞与黑素细胞数及色素颗粒阳性细胞比例（r值分别为 0.36、0.25）均无相关性（P ＞ 0.05）；而非皮损中CD4+T细胞、CD8+T细胞与黑素细胞数呈正相关（r分别为0.46和0.56，均P＜0.05），但是与色素颗粒阳性细胞比例则无相关性（r值分别为0.22、0.02，P ＞ 0.05）。

讨 论

银屑病发病机制复杂，受遗传和环境因素的双重影响，主要表现为T细胞的炎性浸润和表皮角化过度及角化不全［5］。T细胞活化后，主要分化为CD4+和CD8+两大亚群，产生皮肤淋巴细胞相关抗原（CLA）、细胞内黏附分子（ICAM-1）和血管细胞间黏附分子（VCAM-1）等表面分子，使其可以从血管迁移至皮肤，分泌多种细胞因子如白细胞介素（IL）-17、IL-23、IL-6、IL-22、干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及IL-2等，刺激角质形成细胞异常增殖和分化。目前公认CD4+T细胞在银屑病的发病机制中发挥中心作用，启动该病发作，CD8+T细胞可能在皮损维持中起作用。动物模型试验显示，CD4+T细胞可以诱导银屑病的发生，在皮肤异种移植物模型试验中发现，CD4+T细胞可以诱导来源于银屑病患者的正常皮肤发生银屑病［6］。随着皮肤细胞分离技术的发展，发现皮肤中的一些新T细胞亚群，包括 CD4+T 细胞（大部分为 Th1、Th2、Th17、Th22，极少 Treg）、CD8+T 细胞、γδ T 和 NKT 细胞等［7-8］。近期有研究发现，银屑病患者发病时皮损中约20%的CD8+T细胞能分泌IL-17，18.7%分泌IL-22，其中部分CD8+T细胞还能同时分泌IL-17和IL-22，证实银屑病患者皮肤中CD8+T细胞也是IL-17、IL-22和IFN-γ的重要来源［9］。我们的研究发现，在银屑病患者皮损中CD4+T细胞和CD8+T细胞均远多于非皮损及健康人皮肤，CD4+T细胞主要分布在表皮与真皮，而CD8+T细胞主要分布在真皮和真表皮交界处。以上实验结果与以往献报道一致［9-10］。

银屑病患者皮损消退后遗留色素沉着或者色素减退斑是临床上常见的现象，提示黑素细胞参与银屑病的发病机制。黑素细胞来源于神经嵴，可以分泌多种信号分子，包括细胞因子、神经肽以及神经传导物质等，可以影响角质形成细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肥大细胞等，进而起到维持表皮环境稳态的作用。据推测，在银屑病中，黑素细胞可能是表皮的刺激感受器，受刺激的黑素细胞通过分泌信号因子及细胞间连接将信号传至角质形成细胞，然后共同产生更多的炎症因子，引发银屑病发病［1-3］。这可以解释为什么银屑病皮损通常对称分布，多为圆形或椭圆形，而且容易被精神因素所诱发或加重等［11］。

每个黑素细胞通过树突与30～40个角质形成细胞相连，组成一个黑素单位，基底层的黑素细胞与角质形成细胞的比例约为1∶10［12］。黑素细胞、角质形成细胞以及成纤维细胞通过细胞间直接联系和分泌各种细胞因子而相互作用。黑素细胞的增殖、分化以及功能受到多种信号途径的交互作用，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径、黑素细胞刺激素/环磷酸腺苷/激酶 A（α-MSH/cAMP/PKA）途径以及内皮素/激酶C（PKC）途径等，且受到环境（主要是紫外线）以及角质形成细胞和成纤维细胞分泌的细胞因子的影响［12］。

在银屑病发病过程中，角质形成细胞过度增殖伴分化异常，且有大量的炎症因子过度表达。有研究发现，TNF和IL-17两种炎症因子在银屑病皮损中表达升高，诱导角质形成细胞和黑素细胞增殖，导致皮损基底层的黑素细胞数量增加，但同时黑素生成能力却受到抑制［3］。这与我们发现的银屑病患者皮损中黑素细胞数量增多但黑素阳性细胞比例减少一致。研究还发现，在接受依那西普治疗的患者中，大多数都会遗留色素沉着斑。这可能与依那西普阻断TNF从而导致黑素生成能力迅速恢复有关［3］。临床上我们观察到使用阿维A治疗的患者往往会在皮损消退后遗留色素减退斑，我们检测5例经系统阿维A治疗的患者消退期皮损的情况，发现黑素细胞数量及色素颗粒阳性细胞比例与健康人皮肤差距减小，消退后白斑进一步接近但仍然没有达到健康人水平，分析某些炎症因子可能持续存在，局部的黑素生成能力尚未完全恢复，但是，白斑的临床意义有待进一步研究。

在该研究中，我们还分析了CD4+T细胞、CD8+T细胞与黑素细胞的相关性，发现进行期银屑病患者皮损中CD4+、CD8+T细胞数与黑素细胞数及色素颗粒阳性细胞比例均无相关性，而非皮损中CD4+、CD8+细胞数与黑素细胞数有中等程度正相关性，但与色素颗粒阳性细胞比例无明显相关性。表明CD4+T细胞、CD8+T细胞与黑素细胞在数量上可能并无明显相关性。

综上所述，基底层黑素细胞可能在银屑病的发病中起到一定作用。由于消退期皮损获得困难，本研究的样本量较小，而且正常皮肤标本与皮损及非皮损标本来源部位无法完全一致，也可能造成本研究结果一定程度的偏差。关于黑素细胞在银屑病发病机制中的确切作用需要进一步深入研究。

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Detection of T cells and melanocytes in skin of patients with psoriasis and their clinical significance

Luan Chao,Chen Hao,Yang Yonghong,Jiang Yiqun,Liu Yi,Chen Min,Wang Baoxi.Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

Chen Min,Email:drchenmin@126.com

ObjectiveTo investigate the relationship of CD4+and CD8+T cells with melanocytes in skin of patients with psoriasis,and to study their clinical significance.Methods Tissue specimens were obtained from both lesional and nonlesional skin of 29 patients with progressive psoriasis and 5 patients with regressive psoriasis,as well as from normal skin of 6 healthy individuals.Immunohistochemical staining was performed to determine the quantity and distribution of CD4+T and CD8+T cells,as well as the quantity of melanocytes and proportion of cells containing pigment granules in the basal layer of these specimens.Statistical analysis was carried out with the software SPSS 18.0 by one-way analysis of variance（ANOVA）,least significant difference（LSD）test and Pearson correlation analysis.ResultsIn patients with psoriasis,the mean number of CD4+T cells per high-power（× 200）field was significantly larger in lesional skin than in nonlesional skin（epidermis:5.29±4.66 vs.0,P＜0.05;dermis:77.50±43.66 vs.9.67±7.73,P＜0.05）,so was the mean number of CD8+T cells per high-power（×200）field（epidermis:7.83±6.27 vs.0.71±1.20,P＜0.05;dermis:46.08±34.26 vs.5.54±4.43,P＜0.05）.A significant increase was also observed in the number of CD4+and CD8+T cells in lesional skin of patients with psoriasis compared with the normal control skin （bothP＜0.05）.The lesional skin of patients with psoriasis also showed significantly increased number of melanocytes（103.45 ± 16.96）,but decreased proportion of pigment granule-containing cells（7.45% ±3.86%）in the basal layer compared with nonlesionalskin（43.62±14.20,P＜0.05;43.10%±14.91%,P＜0.05）and normal control skin（43.33±14.02,P＜0.05;54.17%±29.40%,P ＜ 0.05）.There were no significant differences in either the mean number of CD4+T cells,CD8+T cells and melanocytes or the proportion of pigment granule-containing cells between nonlesional psoriatic skin and normal control skin（allP ＞ 0.05）.The mean number of melanocytes was significantly higher in regressive psoriatic lesions than in white patches arising in subsided psoriatic lesions（P＜0.05）and normal control skin（P＜0.05）,but similar between white patches and normal control skin （P＞0.05）,while the proportion of pigment granule-containing cells was insignificantly lower in regressive psoriatic lesions than in white patches（P＞0.05）,and significantly lower in regressive psoriatic lesions and white patches than in normal control skin （bothP＜0.05）.Neither the number of CD4+T cells nor that of CD8+T cells was correlated with the number of melanocytes or the proportion of pigment granule-containing cells in progressive psoriatic lesions（bothP＞0.05）,while the number of both CD4+T cells and CD8+T cells was positively correlated with that of melanocytes（r=0.46 and 0.56,respectively,bothP＜0.05）,but uncorrelated with the proportion of pigment granule-containing cells in nonlesional psoriatic skin（bothP ＞ 0.05）.ConclusionsIn progressive psoriatic lesions,there is a significant increase in the number of CD4+and CD8+T cells as well as melanocytes in the basal layer,but a significant decrease in the proportion of pigment granule-containing cells.After subsidence of psoriatic lesions,both the number of melanocytes and proportion of pigment granule-containing cells gradually reach the levels in normal skin of healthy individuals.

Psoriasis;T-lymphocytes;Melanocytes;CD8-positive T-lymphocytes;CD4-positive T-lymphocytes

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.006

卫生部公益性行业科研专项经费（201002016）

210042南京，中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院，江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室

陈敏，Email：drchenmin@126.com

2014-06-05）

（本文编辑：尚淑贤）