D2-40/S100、CD34/S100检测在皮肤恶性黑素瘤脉管转移诊断中的应用

朱小红 张熔熔

·论著·

D2-40/S100、CD34/S100检测在皮肤恶性黑素瘤脉管转移诊断中的应用

朱小红 张熔熔

目的 探讨皮肤恶性黑素瘤（CMM）脉管微转移的免疫组化检测方法及临床意义。方法 经组织病理检查证实的CMM患者53例，男32例，女21例。年龄52～72（61.2±8.4）岁。每例取肿瘤中心部位的瘤组织，部分病例包括清扫淋巴结标本。平均随访时间（65.00±5.68）个月。随访期间17例患者死于CMM复发或转移，6例失访。采用组合式单克隆抗体和双酶标记的免疫组化鸡尾酒法检测53例CMM标本，在同一张组织切片上检测D2-40、S100、CD34抗原的表达情况。结果 53例CMM患者，HE染色+组合式单克隆抗体阳性16例（30.19%），双酶标记的免疫组化鸡尾酒法阳性26例（49.06%），两种方法的阳性率差异有统计学意义（χ2=3.94，P＜0.05）。血管淋巴管瘤栓组26例中21例（80.77%）、无瘤栓组27例中10例（37.04%）有淋巴结转移，两组差异有统计学意义（χ2=10.43，P＜0.001）；血管淋巴管瘤栓组与同期无血管淋巴管瘤栓组5年生存率分别为42.31%（11/26）与70.37%（19/27）（χ2=4.25，P＜0.05）。结论 免疫组化鸡尾酒法检测在诊断血管和淋巴管瘤栓上优于HE+组合式单克隆抗体检查，血管和淋巴瘤栓是CMM患者的重要预后因素。

黑色素瘤；淋巴转移；S100蛋白质类；抗原，CD34；D2-40；免疫组化鸡尾酒法

随着皮肤恶性黑素瘤（CMM）临床病理研究的不断深入，微小转移灶（亚临床病灶）的治疗日益受到重视。本文用组合式单克隆抗体和双酶标记的免疫组化鸡尾酒法检测CMM标本特异性淋巴管标记物（D2-40）、S100蛋白、CD34内皮细胞标记（CD34）抗原的表达情况，分析了淋巴管/血管瘤栓与CMM治疗及预后的相关性，并比较了上述二种方法对CMM肿瘤中及其肿瘤周围淋巴管、血管瘤栓检出率以及检出率高低与淋巴结转移的关系。

资料与方法

一、病例资料

研究对象为2005年1-12月无锡市第二人民医院普外科及皮肤科行CMM手术切除的病例，共53例，其中男32例，女21例。年龄52～72（61.2±8.4）岁。每例取肿瘤中心部位的瘤组织，部分病例包括清扫淋巴结标本。所有病例均经病理证实。随访期末为2010年12月31日，平均随访时间（65.00±5.68）个月。随访期间17例患者死于CMM复发或转移，6例失访。17例死亡患者最短生存时间为7个月，最长生存时间70个月。

二、染色方法

将所有石蜡标本连续4 μm切片6张。3张采用组合式单克隆抗体和2张采用双酶标记的免疫组化鸡尾酒法检测D2-40、S100、CD34抗原的表达情况，1张行HE染色。试剂均为福建迈新生物技术有限公司产品，有单染试剂盒和双染试剂盒，染色方法为SP法。全部标本均用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，采用该公司提供的已知CMM组织切片作阳性对照，操作步骤根据试剂盒说明书操作。

三、结果判断

D2-40阳性染色位于淋巴管内皮细胞胞膜和胞质内，为棕黄色颗粒；免疫组化鸡尾酒法D2-40为黑色。CD34阳性染色位于血管内皮细胞胞膜和胞质内，为棕黄色颗粒；免疫组化鸡尾酒法CD34为黑色；血管、淋巴管为由内皮细胞形成的条状、裂隙状、管状等孤立或簇状结构。S100阳性表达为肿瘤细胞胞质或胞核被染成棕黄色；免疫组化鸡尾酒法S100为红色。CMM组织D2-40/S100、CD34/S100鸡尾酒染色显示，D2-40、CD34阳性物质分别定位于淋巴管、血管内皮细胞的胞膜和胞质，肿瘤细胞表达S100，在部分D2-40、CD34阳性的淋巴管、血管内观察到S100阳性的肿瘤细胞团，作为判断淋巴管、血管内瘤栓的依据。

HE染色明确血管或淋巴管，结合单克隆抗体免疫组化染色该血管或淋巴管内确实为S100阳性的肿瘤细胞；或HE染色明确腔内为肿瘤细胞，结合单克隆抗体免疫组化染色证实该肿瘤细胞位于CD34阳性的血管或D2-40阳性的淋巴管内，则认为该血管或淋巴管内有瘤栓。

四、统计学方法

应用SPSS18.0统计软件包分析处理。两组间的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

53例CMM患者中，HE染色+单克隆抗体免疫组化阳性16例（30.19%），双酶标记的免疫组化鸡尾酒法阳性26例（49.06%），两种方法的阳性率差异有统计学意义（χ2=3.94，P＜0.05）。27例无血管淋巴管瘤栓的患者中有10例（37.04%）已有淋巴结转移，而26例有血管淋巴管瘤栓的患者中21例（80.77%）有淋巴结转移，血管淋巴管瘤栓组淋巴结转移率显著高于无瘤栓组（χ2=10.43，P＜0.001）。见表1。

26例有血管淋巴管瘤栓患者中，血管内瘤栓3例，5年后无1例生存；淋巴管内瘤栓18例，5年后11例生存；血管及淋巴管内均有瘤栓5例，5年后无1例生存。血管瘤栓患者的5年生存率为0，淋巴管瘤栓患者为66.11%。

血管淋巴管瘤栓组26例5年生存率为42.31%（11/26），无血管淋巴管瘤栓组27例为70.37%（19/27），两组差异有统计学意义（χ2=4.25，P ＜ 0.05）。见表1。

讨 论

文献报道［1］，CMM的预后除了与肿瘤的厚度、部位、组织学类型、患者性别以及有无溃疡有密切关联以外，血管和淋巴管浸润也是CMM患者预后的重要因素，血管浸润与患者的生存率显著相关。由于血管、淋巴管内肿瘤细胞数量较少且无任何临床表现，常规的影像学、病理学检查难以发现，因此，应用免疫组化染色区分血管瘤栓和淋巴管瘤栓具有非常重要的临床价值。单纯的HE染色对区分淋巴管和小毛细血管带有主观性，并受主检医生经验的限制，较难鉴别血管、淋巴管或组织间隙（图1）。血管和淋巴管相同起源，很多标记物在血管、淋巴管均有表达，长期以来一直缺乏特异性的免疫标记物区别二者。D2-40是新近发现的特异性淋巴管标记物［2］，它能特异性地与一种唾液酸糖蛋白M2A结合，而M2A仅表达于淋巴管内皮而不表达于血管内皮［3］。CD34是泛血管内皮标记物之一，应用广泛，认为是重复性好、稳定性高、较成熟及相对特异和敏感的血管内皮标记物。S100是广谱S100，其敏感性比HMB-45大，染色强，在CMM的诊断中实用性较大，比较适用于检测常规病理检查难以发现的微转移［4］。

表1 皮肤恶性黑素瘤组织血管淋巴管瘤栓、淋巴结转移与生存率的关系

图1 皮肤恶性黑素瘤组织HE染色观察（HE×200） 1A、1B：明确为脉管组织，但不能确定其内的细胞为肿瘤细胞；1C、1D：明确为肿瘤组织，但不确定其周围为脉管

免疫组化双染法观察不同的抗原成分，步骤繁复，耗时长，需要2次标记，而且反复在一张切片上进行操作容易引起脱片，结果也欠稳定。单染已显示为血管或淋巴管，不能同时确定腔内细胞是否为肿瘤细胞；已显示腔内为肿瘤细胞，不能同时确定腔隙为组织间隙还是脉管（图2）。鸡尾酒标记染色法是针对同一靶组织的不同靶抗原，同步观察几种抗原在病变组织中的不同表达情况，较传统双染方法缩短了实验时间，并有效避免了内源性生物素的干扰，克服了切片间各种差异引起的时间、空间的样本误差，采用抗体组合搭配，结果稳定，且缩减了操作步骤［5］。鸡尾酒双染法可以同时标记血管上皮及肿瘤细胞，如果镜下排除制片因素造成的假象，则可以明确为血管或淋巴管的转移。本研究设计的D2-40/S100、CD34/S100鸡尾酒双染法只需在一张切片上同时加2种抗体，一次就能同步标记D-40/S100、CD34/S100各二种抗体，让我们清晰地看到了血管及淋巴管内的肿瘤细胞（图3），从而能够及时简便地给临床提供诊断。

CMM的转移途径主要是淋巴结转移，CMM淋巴结内转移与否是判断CMM生物学行为的重要参考指标之一，并直接影响肿瘤临床分期的准确性，对预测预后及术后综合治疗具有重要的指导意义［6］。因此是肿瘤根治术后复发和转移的重要原因之一［7］，是为广大学者所公认的对CMM的恶性度判断最有意义的标准。

肿瘤的淋巴管浸润是淋巴结转移的前提，常规诊断很困难。本实验中，在CMM中心区、周边区均可见D2-40染色阳性的淋巴管分布（图2A）。如果淋巴管中查见S100染色阳性的肿瘤细胞，表明这些淋巴管内已有瘤栓形成，肿瘤侵犯血管。提示CMM淋巴结转移可能主要是通过瘤组织边缘区淋巴管引起的。D2-40/S100抗体鸡尾酒法在一张切片上清楚地观察到肿瘤细胞S100蛋白的表达情况（图3A、3B）、肿瘤微淋巴管密度以及淋巴管侵犯的情况，提供的结果信息量大，标记结果易于判断，可更直观清晰地辨别肿瘤细胞和淋巴管的关系，易于检出被肿瘤侵犯的微淋巴管。同样，CD34/S100抗体鸡尾酒法在一张切片上清楚地观察到肿瘤细胞S100蛋白在血管内的表达情况（图3C、3D），说明肿瘤侵犯血管。鸡尾酒标记染色法的阳性检出率明显高于HE染色组合单克隆抗体染色法，该方法的建立对于进一步探讨CMM血管淋巴管转移的特点、评估患者的预后，指导临床术后治疗均有帮助。

图2 皮肤恶性黑素瘤组织免疫组化单染法观察（免疫组化SP法×200） 2A：D2-40显示淋巴管阳性，不能明确其内细胞是否为肿瘤细胞；2B：CD34显示血管阳性，不能确定其内细胞是否为肿瘤细胞；2C、2D：S100显示肿瘤组织阳性，不能确定其是否在脉管内

图3 皮肤恶性黑素瘤组织D2-40/S100、CD34/S100鸡尾酒染色观察（鸡尾酒双染SP法×200） 3A、3B：D2-40显示淋巴管阳性，S100显示肿瘤细胞阳性；3C、3D：CD34显示血管阳性，S100显示肿瘤细胞阳性

本试验中我们观察到，检测出血管淋巴管瘤栓的26例患者中有淋巴结转移的为21例，淋巴结转移的患者明显高于无血管淋巴管瘤栓的患者。26例血管淋巴管瘤栓患者中8例累及血管的患者5年后无1例生存，提示肿瘤周围血管淋巴管瘤栓对恶性黑素瘤患者的预后有一定的影响［8］，它的存在提示外科治疗中淋巴结清扫的重要意义，淋巴管内见到瘤栓，其临床意义等同于淋巴结转移，血管内查见瘤栓是CMM预后差的指标之一。

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2015年英夫利西单抗（类克®）临床应用有奖征文通知

银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤病，其患病率呈上升趋势，估计中国至少有600万银屑病患者。随着科学的进步和对疾病的认识，生物制剂已经成为治疗银屑病的新选择。为了促进皮肤科医师对生物制剂的认识和交流，西安杨森制药有限公司与中华皮肤科杂志编辑部联合举办英夫利西单抗（类克®）临床应用有奖征文活动。2014年征文收到数十篇高质量的文章，将择优刊登在中华皮肤科杂志上。本次征文活动得到皮肤科医师的欢迎，因此，从2015年继续进行有奖征文活动，旨在与皮肤科医生携手，交流生物制剂治疗银屑病的经验，共同促进银屑病治疗的发展。

一、征文范围：英夫利西单抗治疗重度斑块型银屑病的图片和内容展示。

二、征文要求：①未在公开出版的杂志上发表，未在全国性学术会议上交流；②应征论文写作格式请参考中华皮肤科杂志稿约要求；③至少提供患者3组照片，治疗前、2周、6周的照片；④请注明第一作者姓名、单位、职称、地址、邮编、电子邮箱以及联系电话；⑤只接受电子邮箱投稿（Word排版），征文电子版发至邮箱beauty_life2014@163.com，并注明“美丽人生征文”字样。所有征文恕不退稿，请自留底稿。征文截稿时间：2015年9月30日。

三、评选方法和奖项设置：由知名专家及相关专业专家组成评审委员会，对征文稿件进行评审。奖项设置：获前10名文章作者，资助第一作者参加2016年中华医学会皮肤性病学学术年会；其余参与投稿第一作者，均赠阅中华皮肤科杂志2016年全年杂志。

2015年全国皮肤外科、抗衰老及美容学习班通知

为提高皮肤美容及皮肤老化治疗水平，由中国中西医结合学会皮肤性病学专业委员会、中国整形美容协会抗衰老分会主办，重庆市中医院暨重庆市第一人民医院承办的全国皮肤外科、抗衰老及美容学习班，定于2015年5月15-17日在重庆市举办。届时将邀请国内知名专家赵启明、刁庆春、方方等教授就皮肤美容外科的基础及临床进行系统讲座。学习内容涉及皮肤肿瘤、瘢痕与瘢痕疙瘩、皮肤老化、注射微美容、激光、光动力技术的应用等。学习结束经考核合格后，颁发中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会、中国整形美容协会抗衰老分会皮肤外科、抗衰老及美容学习班结业证书，并授予国家级Ⅰ类继续医学教育学分。学习班联系人：蒲杨 13996088144，Email：1354468542@qq.com，汪蓉 13883103189，Email：gyz917@126.com。

Application of D2-40/S100 and CD34/S100 detection in the diagnosis of blood and lymphatic vessel invasion of cutaneous malignant melanoma

Zhu Xiaohong,Zhang Rongrong.Department of Dermatology,Wuxi No.2 People′s Hospital,Wuxi 214002,Jiangsu,China

Zhang Rongrong,Email:852718606@qq.com

ObjectiveTo develop an immunohistochemical assay for the diagnosis of cutaneous malignant melanoma（CMM）micrometastasis via blood and lymphatic vessels,and to evaluate its clinical significance.MethodsFifty-three patients （32 males and 21 females）histopathologically diagnosed as CMM were enrolled in this study.The patients were aged （61.2±8.4）years（range,52－72 years）.Tissue specimens were obtained from the central area of tumor in each case,and also from removed lymph nodes in some cases.The average duration of follow-up was（65.00±5.68）months.During the follow-up,17 patients died of the recurrence or metastasis of CMM,and 6 patients were lost to follow-up.The expressions of D2-40,S100 and CD34 antigens in 53 tissue specimens were examined by immunohistochemical staining with three individual monoclonal antibodies,or by an immunohistochemical method using 2 two-antibody cocktails （D2-40/S100 and CD34/S100）and double-color chromogens in single tissue sections.ResultsOf the 53 patients,30.19% （16/53） were positive for hematoxylin-eosin （HE） staining combined with immunohistochemical staining with individual monoclonal antibodies,and 49.06%（26/53）for the immunohistochemical method using two-antibody cocktails and double-color chromogens.Statistical differences were found in the positive rate between the two methods（χ2=3.94,P＜0.05）.Compared with patients without blood/lymph vessel tumor emboli,those with blood/lymph vessel tumor emboli showed higher lymph node metastasis rate（80.77%（21/26）vs.37.04%（10/27）,χ2=10.43,P ＜ 0.001）,but lower five-year survival rate （42.31% （11/26）vs.70.37% （19/27）,χ2=4.25,P ＜ 0.05）.ConclusionsThe immunohistochemical method with two-antibody cocktails is superior to HE staining combined with immunohistochemical staining with individual monoclonal antibodies in the detection of blood/lymph vessel tumor emboli.And blood/lymph vessel tumor emboli may be an important prognostic factor in patients with CMM.

Melanoma;Lymphatic metastasis;S100 proteins;Antigens,CD34;D2-40;Immunohistochemical method with antibody cocktails

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.012

214002江苏，无锡市第二人民医院皮肤科

张熔熔，Email：852718606@qq.com

2014-09-01）

（本文编辑：颜艳）