银屑病患者皮损和外周血中CD8α+α+T 细胞的研究

孙秀文 李冰 张伟刚 党二乐 晋亮 王刚

·论著·

银屑病患者皮损和外周血中CD8α+α+T 细胞的研究

孙秀文 李冰 张伟刚 党二乐 晋亮 王刚

目的 观察银屑病患者皮损和外周血中CD8α+α+T细胞的分布和比例，探讨其在银屑病发病中的作用。方法 采用免疫荧光技术观察5例进展期寻常性银屑病患者和5例健康人皮肤中CD8α+α+T细胞的分布，流式细胞仪分别检测10例进展期寻常性银屑病患者和8例健康人外周血中CD8α+α+T细胞比例及干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达。采用Graphpad Prism统计软件对实验组和对照组各数据进行t检验。结果 在5例银屑病患者皮损真皮浅层均可见以CD8α+α+T细胞为主的浸润，未见明显的CD8α+β+T细胞浸润；而5例健康人皮肤中均未见CD8α+α+T细胞和CD8α+β+T细胞浸润。流式细胞仪检测，8例健康人外周血中CD8α+α+T细胞比例为9.12%±4.80%，10例银屑病患者组为26.47%±12.99%，银屑病患者组明显高于对照组，两组比较，t=3.96，P＜0.001。在银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的细胞比例分别为47.36%±19.38%和54.14%±21.14%，健康对照组分别为13.44%±9.21%和34.03%±17.22%，两组差异均有统计学意义（t值分别为4.54和2.17，P值分别＜0.001和＜0.05）。结论 银屑病患者皮损和外周血中存在CD8α+α+T细胞的分布和比例增多，CD8α+α+T细胞可能是参与银屑病发病的主要CD8+T细胞亚群。

银屑病；CD8阳性T淋巴细胞；干扰素γ；肿瘤坏死因子α

目前认为，T淋巴细胞活化及其分泌的促炎因子是银屑病发病的中心环节［1］。以往的研究认为，CD4+T细胞是银屑病炎症因子的主要来源［2］。然而近年研究发现，γδT细胞和CD8+T细胞也会分泌大量炎症因子参与各种自身免疫性疾病发病［3-4］。随着对CD8+T细胞亚群认识地逐渐深入，发现不同的CD8+T亚群在感染、肿瘤及自身免疫性疾病中的作用也不同。目前认为，CD8α+β+T细胞主要是杀伤性T 细胞，而 CD8α+α+T 细胞主要分泌细胞因子［5］。有研究报道，CD8+T细胞可以通过分泌炎症因子参与银屑病发病［4］，但其亚群在银屑病发病中的作用及机制仍未明确。我们采用免疫荧光技术及流式细胞分析法对寻常性银屑病患者皮损及外周血CD8α+α+T细胞的表达及分泌的细胞因子进行分析。

材料与方法

一、临床资料

收集2013年9月至2014年4月我科门诊10例进展期寻常性银屑病患者外周血，所有患者1个月内未使用药物治疗；收取8例健康志愿者外周血作为对照组，患者及健康志愿者1个月内均未患上呼吸道感染等感染性疾病。10例患者中男6例，女4例，年龄18～55岁，平均37岁；8例健康志愿者中男5例，女3例，年龄20～55岁，平均35岁。5例进展期寻常性银屑病患者皮损来源于活检手术取材，5例健康对照组皮肤来源于植皮术修剪剩余皮肤。皮损与外周血检测为同组患者。本研究经第四军医大学西京医院伦理委员会批准，所有受试者均知情同意。

二、材料

兔抗人CD8α单抗、鼠抗人CD8β多抗为美国abcam公司产品，单克隆抗体鼠抗人CD8α PECyanine 5、CD8β PE-Cyanine 7、固定/通透稀释剂、固定/通透浓缩剂、通透缓冲液10×和细胞因子刺激剂为美国eBioscience公司产品，单克隆抗体鼠抗人干扰素 γ（IFN-γ）FITC、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）Alexa Fluor 488为美国BioLegend公司产品。

三、方法

1.免疫荧光：取银屑病患者皮损进行4%甲醛固定，石蜡包埋、切片，常规脱蜡至水，并将切片浸入3%H2O2封闭液封闭；高压修复；滴加稀释后的一抗 50 μl，4℃过夜；第 2天室温复温 1 h，滴加二抗复合物，每张切片50 μl，室温放置45 min；洗涤液冲洗；滴加DAPI复合物，室温放置10 min；洗涤液反复冲洗，甘油封片。激光共聚焦方法进行图像采集。

2.淋巴细胞分离：抽取静脉血5 ml，肝素抗凝，与等体积磷酸盐缓冲液（PBS）混匀，加入到等体积的淋巴细胞分离液离心管中，离心，取中间淋巴细胞层，加PBS溶液离心，弃上清；加入红细胞裂解液5 min，加入PBS溶液终止，离心，弃上清；用含10%血清的RPMI 1640培养基重悬培养，置入6孔板中备用。

3.流式细胞鉴定：收集6孔板中的外周血单一核细胞于无菌流式管中吹匀，离心，弃上清；加入1 ml含10%血清的RPMI 1640培养基混匀，并加2 μl细胞因子刺激剂混匀，37℃孵箱中封闭4 h；1.5 ml流式洗涤液离心，弃上清，加入100 μl流式洗涤液吹匀，加入CD8α和CD8β抗体，并设相应的单标，4℃避光30 min；加入1.5 ml流式洗涤液离心，弃上清，加入按3∶1稀释的固定/通透稀释剂和固定/通透浓缩剂 200 μl，室温避光 30 min；加入 1.5 ml流式洗涤液离心，弃上清，并重复1次，加以通透缓冲液10×与PBS按1∶9稀释后的液体1 ml，混匀，离心，弃上清，加IFN-γ及TNF-α抗体，4℃避光2 h；加入1.5 ml流式洗涤液离心，弃上清，加入固定液200 μl混匀，上流式细胞仪检测。

4.统计分析：应用Graphpad Prism统计软件进行统计分析，均数以±s表示，两组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、银屑病皮损中CD8α+α+T细胞的分布

5例银屑病患者皮损表皮及真皮浅层均可见以CD8α+α+T 细胞为主的浸润，未见明显的 CD8α+β+T细胞浸润；而5例健康人皮肤中均未见CD8α+α+T细胞和CD8α+β+T细胞浸润。见图1。

二、银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞比例

流式细胞仪检测10例进展期寻常性银屑病患者和8例健康人外周血中CD8α+α+T细胞比例，结果发现，健康对照组外周血CD8α+α+T细胞比例为9.12%±4.80%，银屑病患者组为26.47%±12.99%，两组比较，t=3.96，P ＜ 0.001。见图 2。

三、银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞亚群中细胞因子的表达

在进展期寻常性银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的细胞比例分别为47.36%±19.38%和54.14%±21.14%，健康对照组分别为13.44%±9.21%和34.03%±17.22%，两组比较，差异均有统计学意义（t值分别为4.54和2.17，P值分别＜0.001和＜0.05）。见图3。

讨 论

银屑病是多基因遗传背景介导下的慢性炎症性疾病，严重影响患者的身心健康，其发病机制尚未阐明［6］。现普遍认为，T细胞是银屑病免疫紊乱形成的主导者，其异常活化是银屑病发病的中心环节［7］。T细胞活化后，释放大量的炎症因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-17等，参与银屑病的发生及发展［8］。

图1 免疫荧光检测寻常性银屑病患者皮损CD8α及CD8β表达情况（×20） 健康人皮肤全层未见CD8α及CD8β阳性T细胞浸润，银屑病患者皮损可见CD8α阳性T细胞浸润及散在CD8β阳性T细胞，以真皮浅层为主

图2 流式细胞仪检测健康人8例与寻常性银屑病患者10例外周血中CD8α+α+T细胞比例 与健康对照组相比，银屑病患者外周血中CD8α+α+T细胞比例明显增高 2A：对照组和银屑病患者组外周血中CD8α+α+T细胞流式细胞仪检测结果；2B：对照组和患者组CD8α+α+T细胞和CD8α+β+T细胞的构成比

图3 流式细胞仪检测健康人8例与寻常性银屑病患者10例外周血CD8α+α+T细胞亚群中细胞因子的表达 银屑病患者外周血中CD8α+α+T细胞表达IFN-γ和TNF-α的水平均明显高于健康对照组

CD8+T细胞起源于骨髓，在胸腺内发育成熟，成熟后随着淋巴循环到达全身各处，外周CD8+T细胞主要分布在脾脏、扁桃体和淋巴结等器官中［9］。T细胞表面CD8分子主要参与TCR的亲和力调控。功能性CD8分子是由CD8α链和CD8β链形成的异源或同源二聚体，据此CD8+T细胞可分为CD8α+α+T细胞与CD8α+β+T细胞两个亚型，且其功能有着显著的差别［5］。CD8αβ能够提高TCR的亲合力，CD8αα可以降低TCR的抗原敏感性［5］。以往，学者们普遍认为，CD8α+α+T细胞具有负向免疫调控作用。然而，近期 Zhu 等［10］发现，CD8α+α+T 细胞长期定位在生殖器皮肤和黏膜内，发挥着免疫监控功能，抑制病毒感染，对生殖器疱疹的复发发挥着重要的抑制作用；疱疹皮损愈合后，皮损局部CD8α+β+T细胞被完全清除，而CD8α+α+T细胞可在局部持续存在。

以往研究认为，银屑病炎症因子主要来源于CD4+辅助性 T 细胞（Th）［11-12］。近年研究发现，CD8+T细胞在银屑病的发病中也发挥着重要的作用［13］，银屑病患者皮损中可见CD8+T细胞浸润［4］。银屑病中CD8+T 细胞可通过分泌 IL-17、IL-21、IFN-γ 及TNF-α等细胞因子参与疾病的发病［14］。但是哪一类CD8+T细胞亚群在银屑病发病中发挥致病作用及其机制尚不清楚。

本研究发现，与健康人相比，银屑病患者外周血中CD8α+α+T细胞比例明显升高。此外，银屑病患者CD8α+α+T细胞表达IFN-γ和TNF-α水平均明显增高。该研究发现，CD8α+α+T细胞亚群通过分泌炎症因子参与银屑病发病，明确了CD8+T细胞亚群在银屑病发病中作用。此外，该研究发现了银屑病患者CD8α+α+T细胞的促炎作用，拓展并完善了对CD8+T细胞亚群及其功能的认识，为CD8+T细胞在自身免疫病及炎症性疾病中的作用研究提供了新思路。

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第六届全国深部真菌感染学术会议征文通知

全国深部真菌感染学术会议是由感染、呼吸、血液、皮肤、重症医学等多学科权威专家于2005年共同组织发起的，旨在为深部真菌研究人员提供一个沟通和交流的平台，真正实现多学科协作与交流。第六届会议定于2015年11月27－29日在安徽合肥召开，由国家卫生计生委医药卫生科技发展研究中心主办。会议将邀请国内外知名专家就深部真菌感染的流行病学、临床诊治以及病案讨论等最新研究成果展开交流与讨论。同时欢迎从事相关研究的学者踊跃投稿参会。

征文内容：①深部真菌感染的病原学、流行病学、组织病理学、发病机制等基础研究；②深部真菌感染的诊断学，包括实验室诊断和影像学诊断；③深部真菌感染的临床诊治研究；④抗真菌药物研究；⑤典型病例讨论。

征文要求：投稿请提供论文摘要，应包括研究目的、材料和方法、结果、结论，字数400～800字。截稿日期：2015年9月30日。

论文评审：组委会邀请权威专家对论文进行评审，优秀论文将颁发获奖证书并给予一定的奖励，部分优秀论文可推荐至相关专业杂志发表。

会议注册及学分：参会代表可授予国家级继续医学教育项目Ⅰ类学分10分。

投稿邮箱：sbzj2015@163.com，官方微信号：fungalinfection，联系人：马立英，电话/传真：010－65041809/65005315。

CD8α+α+T cells in lesions and peripheral blood of patients with psoriasis

Sun Xiuwen,Li Bing,Zhang Weigang,Dang Erle,Jin Liang,Wang Gang.Department of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

Wang Gang,Email:xjwgang@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the distribution and proportion of CD8α+α+T cells in lesions and peripheral blood of patients with psoriasis,and to assess their roles in the pathogenesis of psoriasis.Methods An immunofluorescence assay was performed to observe the distribution of CD8α+α+T cells in lesions of 5 patients with progressive psoriasis vulgaris and normal skin of 5 healthy human controls.Flow cytometry was conducted to determine the proportion ofCD8α+α+T cells,and to measure the expressions of interferon（IFN）-γ and tumor necrosis factor（TNF）-α in peripheral blood from 10 patients with progressive psoriasis vulgaris and 8 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest with GraphPad Prism software.ResultsA massive infiltrate mainly composed of CD8α+α+T cells but not CD8α+β+T cells was observed in the upper dermis of lesions from the 5 patients with psoriasis,while there was no infiltrate of CD8α+β+or CD8α+α+T cells in the normal skin of 5 healthy human controls.Flow cytometry revealed that the proportion of CD8α+α+T cells was significantly higher in peripheral blood from 10 patients with psoriasis than in that from 8 healthy human controls（26.47%±12.99%vs.9.12%±4.80%,t=3.96,P＜0.001）.Significant differences were also noted between the psoriatic patients and healthy human controls in the percentage of cells secreting IFN-γ（47.36% ±19.38%vs.13.44% ±9.21%,t=4.54,P＜0.001）and cells secreting TNF-α （54.14% ±21.14%vs.34.03% ± 17.22%,t=2.17,P ＜ 0.05）in peripheral blood CD8α+α+T cells.ConclusionsBoth the distribution and proportion of CD8α+α+T cells are increased in lesions and peripheral blood from patients with psoriasis,suggesting that CD8α+α+T cells may be the main subgroup of CD8+T cells that contribute to the pathogenesis of psoriasis.

Psoriasis;CD8-positive T-lymphocytes;Interferon-gamma;Tumor necrosis factor-alpha

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.003

国家自然科学基金（81171494）

710032西安，第四军医大学西京皮肤医院

王刚，Email：xjwgang@fmmu.edu.cn

2014-06-19）

（本文编辑：颜艳）