活血通络解毒方对脑缺血Wistar大鼠炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影响*

贾　芸　易燕锋　艾宗耀　肖梅红　嵇　冰杨春华陆周翔

（1.湖州师范学院医学院，浙江湖州313000；2.浙江中医药大学附属湖州中医院，浙江湖州313000）

·研究报告·

活血通络解毒方对脑缺血Wistar大鼠炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影响*

贾芸1易燕锋1艾宗耀2△肖梅红2嵇冰2杨春华2陆周翔2

（1.湖州师范学院医学院，浙江湖州313000；2.浙江中医药大学附属湖州中医院，浙江湖州313000）

目的研究活血通络解毒方对脑缺血Wistar大鼠神经缺损功能评分及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的影响。方法60只雄性Wistar大鼠随机分成假手术组，模型组，活血通络解毒方低剂量组、中剂量组、高剂量组5组。大鼠大脑中动脉栓塞模型造模成功24 h、7 d、14 d后，各组给予相应处理，分别分析比较检查各组神经功能评分情况及TNF-α、IL-1β、IL-6水平。结果假手术组无大鼠死亡，模型组死亡2只，分别死于术后第2日、第8日，活血通络解毒方高剂量组死亡2只，分别死于术后第6日和第9日。活血通络解毒方中、低剂量组未见动物死亡。造模后各组大鼠神经功能缺损评分与假手术组比较均升高（P＜0.01）。各治疗组在治疗后其评分与模型组比较均降低（均P＜0.05），且中剂量组神经功能缺失评分第7 d明显低于模型组（P＜0.01）。治疗中剂量组神经功能缺失评分从术后第7日、14日均低于高剂量组和低剂量组（P＜0.05），高剂量组和低剂量组评分差别不大（P＞0.05）。造模后24 h各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平与假手术组比较均明显升高（均P＜0.05），而模型组、高、中、低剂量组间比较则差别不大（均P＞0.05）。术后2周假手术组、模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平与本组术后24 h比较差别不大（均P＞0.05）；术后2周高、中、低剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平与本组术后24 h比较均下降（均P＜0.05），且中剂量组下降最明显（P＜0.05）。术后2周高、中、低剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平与模型组同期比较均下降（均P＜0.05）。结论活血通络解毒方可改善缺血性Wistar大鼠神经功能缺损评分及其炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，这可能是干预脑梗死的机制之一。

脑梗死脑缺血再灌注炎症细胞因子活血通络解毒方实验研究

急性脑梗死是由于脑部供血障碍，引起脑组织缺血性坏死的一类疾病，前期笔者通过临床研究发现活血通络解毒方对急性脑梗死患者有较好的临床疗效［1］，拟进一步探讨其作用机制，观察活血通络解毒方对脑缺血Wistar大鼠神经功能缺损程度评分及炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性Wistar大鼠，体质量（280± 20）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供［合格证号SCXK（浙）2003-0003，经检疫合格备用］。大鼠在24～25℃下分笼饲养，保持相对湿度约为12%、光照明暗比为13∶1。

1.2试剂与器材活血通络解毒方：茯苓15 g，玄参10 g，金银花12 g，当归10 g，赤芍10 g，大黄3 g，栀子10 g，川芎6 g，地龙10 g，红花10 g，全蝎3 g，甘草6 g。中药液（中药材由浙江中药材公司提供）由浙江中医药大学附属湖州中医院药剂科配制。原药材经煎煮后，去除药渣留取药液，将药液浓缩至每毫升含原生药材2 g作为高剂量组，每毫升含原生药材1 g为中剂量组，每毫升含原生药材0.5g为低剂量组。10%水合氯醛（上海西唐生物技术有限公司提供，批号ws20131012）；0.9%氯化钠注射液（浙江莎普爱思药业股份有限公司提供，批号140914-1C）；5%聚维酮碘溶液（杭州民生药业有限公司提供，批号591409111）；Elisa试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-6（武汉博士德生物工程有限公司）。电子分析天平仪Sartorius AG（德国）；离心机（江苏华大离心机股份有限公司）；721分光光度计（上海予腾生物科技有限公司）；多谱酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；眼科手术剪、止血钳、动脉夹、手术缝合针、线，试管，Eppendof管（上海医疗器械（集团）有限公司）；鱼线：Ф=0.21 mm（威海润泽进出口有限公司）。

1.3分组与造模将Wistar雄性大鼠按照改良Longa等［2］法建立大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型。造模成功后按随机数字表法分组为假手术组、模型组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组各12只。庆大霉素按照每日35 mg/kg大鼠体质量抗感染，腹腔注射3 d。Wistar大鼠在再灌注术后完全苏醒后，参照改良Berdson评分分级法分别观察大鼠神经和行为学改变。评分≥2分者表示模型制作成功，纳入实验。

1.4给药大鼠所用药物等效剂量按照成人的临床日用量与体质量折算系数比，再计算出相当于高、中、低剂量的药量。每毫升含原生药材2 g作为高剂量组，每毫升含原生药材1 g为中剂量组，每毫升含原生药材0.5 g为低剂量组。每天用活血通络解毒方灌胃1次，术后24 h后给药。模型组和假手术组按照相同的方法分别给予相同体积0.9%氯化钠注射液灌胃。各组用药时间均为14 d。

1.5观察指标分别于术后当日，术后第1日、第7日、第14日进行神经行为学评分。评分方法与造模后的神经行为学的评分方法相同。术后24 h、14 d分别经大鼠尾静脉、腹主动脉取血检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度。

1.6统计学处理采用SPSS13.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析、配对t检验和重复方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠死亡情况比较截止实验结束，假手术组无大鼠死亡，模型组死亡2只，分别死于术后第2日、第8日，活血通络解毒方高剂量组死亡2只，分别死于术后第6日和第9日。活血通络解毒方中、低剂量组未见动物死亡。

2.2治疗过程中各组大鼠的神经功能缺损评分比较见表1。造模后各组大鼠神经功能缺损程度评分与假手术组比较均升高（P＜0.01）。各治疗组在治疗后其评分与模型组比较均降低（均P＜0.05），且中剂量组神经功能缺损程度评分第7日明显低于模型组（P＜0.01）。治疗中剂量组神经功能缺损程度评分从术后第7日、14日均低于高剂量组和低剂量组（P＜0.05），高剂量组和低剂量组评分差别不大（P＞0.05）。

表1　各组大鼠不同时期神经功能缺损程度评分比较（分，）

表1　各组大鼠不同时期神经功能缺损程度评分比较（分，）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组同期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与高剂量组、低剂量组比较，●P＜0.05。

组别术后24 h术后7 d n评分n假手术组12012模型组12 9.2±1.2*11高剂量组12 9.4±1.0*11中剂量组12 9.3±1.3*12低剂量组12 9.3±1.1*12术后14 d评分n评分0120 9.1±1.3*10 8.8±2.1*7.1±1.8*△10 6.6±1.7*△5.6±2.3*△△●12 4.8±1.7*△△●7.3±3.2*△12 6.9±1.4*△

2.3治疗前后各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较见表2。造模后24 h各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平与假手术组比较均明显升高（均P＜0.05），而模型组、高、中、低剂量组间比较则差别不大（均P＞0.05）。术后2周假手术组、模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平与本组术后24 h比较差别不大（均P＞0.05）；术后2周高、中、低剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平与本组术后24 h比较均下降（均P＜0.05），且中剂量组下降最明显（P＜0.05）。术后2周高、中、低剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平与模型组同期比较均下降（均P＜0.05）。

表2　各组Wistar大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（）

表2　各组Wistar大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（）

与假手术组比较，＃P＜0.05；与本组术后24 h比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，△P＜0.05；与高剂量组、低剂量组比较，●P＜0.05。

组别时间IL-6（pg/mL）假手术组术后24 h0.61±0.10（n＝12）术后2周0.59±0.13模型组术后24 h1.53±0.15＃TNF-α（ng/mL）IL-1β（pg/mL）1.27±0.161.33±0.89 1.23±0.221.43±0.61 2.64±0.36＃2.27±0.86＃（n＝12）术后2周1.49±0.20 2.59±0.352.16±0.75高剂量组术后24 h2.38±0.21＃2.24±0.81＃1.14±0.13＃（n＝12）术后2周1.61±0.30*△1.81±0.80*△0.72±0.16*△中剂量组术后24 h2.45±0.35＃2.21±0.74＃1.12±0.21＃（n＝12）术后2周1.30±0.21*△●1.38±0.66*△●0.60±0.14*△●低剂量组术后24 h2.50±0.23＃2.26±0.82＃1.50±0.12＃（n＝12）术后2周1.78±0.33*△1.89±0.76*△0.80±0.11*△

3　讨论

Bothe等研究证实，检测神经元缺血损伤的唯一手段是行为学检查所提示的功能异常，该检测方法不能被任何其他方法所替代［3］。本实验结果示，造模后各组大鼠均有一定程度的神经功能缺失改变，采用相应治疗后，活血通络解毒方各剂量组均能明显改善神经功能缺损症状，降低脑缺血再灌注大鼠神经症状评分，促进神经功能恢复，中剂量组尤为明显。在术后14 d，中剂量组神经功能缺失评分明显低于高剂量组和低剂量组，有统计学意义。由此可以看出，在改善神经功能障碍及起效时间方面中剂量治疗具有更明显优势。

中医治疗缺血性中风有着悠久的历史。许多研究表明，瘀血内阻贯穿疾病的全部过程并且急性期毒损脑络是重要的病机［4］。有业者认为中风病毒邪深入血络，与瘀血相搏，形成毒瘀互结，损伤脑髓、脑脉，因此治疗上除了一般的活血化瘀之外，还应重视解毒［5］。活血通络解毒方以活血化瘀、解毒通络为大法，方中金银花、大黄、栀子清热解毒；红花、桃仁、当归、赤芍、川芎活血化瘀，全蝎、地龙祛风通络。全方共奏活血化瘀、解毒通络之功。

脑梗死过程中炎症反应促进了脑缺血损伤的发展，是加重缺血性脑损伤和神经损伤的重要病理机制之一［6-7］。脑缺血损伤后在缺血受损区有细胞因子的过量表达和炎性细胞浸润，过量炎症因子的产生能加重神经细胞损伤［8］。尤其是TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子［9-10］过度释放，致使血脑屏障受损，加重脑损伤及脑水肿，形成缺血炎症恶性循环。动物实验表明［11］，脑缺血大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6相关细胞因子均升高。造模后24 h各组大鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6均有明显升高。术后2周假手术组、模型组炎性细胞因子差别不大；高、中、低剂量组炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）与造模后24 h比较均下降，以中剂量组下降最为明显，术后2周高、中、低剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平与模型组同期比较均下降，表明活血通络解毒方可通过降低脑缺血再灌注Wistar大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，保护脑缺血大鼠脑组织。

综上所述，活血通络解毒方具有促进脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复的作用，其作用机理可能是通过降低血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平而达到改善神经功能的作用。由于脑梗死急性期多种炎症因子及细胞因子发挥作用，致病机理复杂，因此需要进一步深入研究。

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The Effect of Huoxue Tongluo Jiedu Decoction on Inflammatory Cytokine TNF-α，IL-1β and IL-6 of Rats with Cerebral Ischemia Wistar

JIA Yun，YI Yanfeng，AI Zongyao，et al.
Medical School of Huzhou U-niversity，Zhejiang，Huzhou 313000，China

【Abstracrt】Objective：To Study the efficacy of Huoxue tongluo jiedu Decoction on inflammatory cytokine TNF-α，IL-1β，IL-6 of rats with cerebral ischemia Wistar.Methods：Sixty Wistar Mice were randomly devided into sham-operated group，the model group，group with low level of Huoxue tongluo jiedu Decoction，group with moderate level，and group with high level.The middle cerebral artery occlusion reperfusion model in rats was built according to Longa.24h after finishing modeling and 7 and 14 days after the treatment，the level of TNF-α，IL-1β and IL-6 of each group were detected，and the neurobehavioral change was observed.Results：At the end of the experiment，there were no rats dead in sham operation group and group with low level，2 in the model group on 2nd and 8th day respectively after operation，2 in group with high level on 6th and 9th day respectively after operation.After finishing modeling，compared with sham operation group，Neurological deficit scores of other groups significantly increased，with statistical significance（P＜0.01）.Compared with the model group，the situation of neural function was improved，and the level of TNF-α，IL-1β and IL-6 of each group increased（P＜0.05）.After 14 days′treatment，the level of TNF-α，IL-1β and IL-6 of each group decreased，among which，the group with moderate dose decreased the most（P＜0.05）.Conclusion：Huoxue tongluo jiedu Decoction can improve Neurological deficit scores and decrease the level of TNF-α，IL-1β，IL-6，which may be one of the mechanisms ofcerebral infarction.

Cerebral infarction；Cerebral ischemia reperfusion；Inflammatory cytokine；Huoxue tongluo jiedu Decoction；Experimental study

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2079-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.004

2015-07-26）

浙江省中医药科技计划项目（2013ZB126）；湖州师范学院科学研究项目（KY2013025）

（电子邮箱：azy5765@sina.com）