上调miR-34c-5p对鼻咽癌细胞HONE-1增殖和侵袭的影响

马菲菲，郝彦强，王国强，张鑫，郅程，冀天星

上调miR-34c-5p对鼻咽癌细胞HONE-1增殖和侵袭的影响

马菲菲1，郝彦强2，王国强3，张鑫4，郅程5，冀天星6∆

目的探讨上调miR-34c-5p对鼻咽癌细胞HONE-1增殖和转移能力的影响。方法利用定量PCR分析miR-34c-5p在鼻咽癌细胞株HONE-1和正常鼻咽细胞株NP69中的表达情况；利用克隆形成实验和Transwell实验分析上调miR-34c-5p表达对miR-34c-5p mimic转染组、miR-34c-5p对照序列组和未处理组增殖和侵袭能力的影响。结果miR-34c-5p在鼻咽癌细胞株HONE-1的表达水平低于正常鼻咽细胞株NP69；miR-34c-5p mimic转染组鼻咽癌细胞HONE-1的克隆形成和侵袭能力明显低于miR-34c-5p对照序列组和未处理组（均P＜0.05）。结论miR-34c-5p的下调与鼻咽癌的生物学功能增殖和侵袭能力相关，是鼻咽癌治疗的潜在靶点。

鼻咽肿瘤；细胞增殖；肿瘤侵润；体外研究；miR-34c-5p；HONE-1

鼻咽癌在我国华南地区的发病率为万分之一～万分之三［1］。近年来鼻咽癌患者经放化疗后5年存活率有所提高，但术后复发和转移等仍严重威胁着患者的生命［2］。miR-34家族成员包括miR-34a、miR-34b、miR-34c-5p、miR-34c-3p，其在多种肿瘤中呈较低表达水平，且miR-34家族成员的低表达与多种肿瘤的发生和发展密切相关，是肿瘤治疗的潜在靶标［3］。不同肿瘤中miR-34家族成员的失调的种类不同，如在鼻咽癌组织中miR-34b和miR-34c的表达水平低于正常鼻咽部组织，而miR-34a无差异性［4］。miR-34c-5p在鼻咽癌的发生和发展中起重要作用，但有关其具体作用及机制仍未明确。本研究旨在探讨miR-34c-5p对鼻咽癌细胞株HONE-1增殖和侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料鼻咽癌细胞株HONE-1和正常鼻咽部细胞株NP69由广东医学院李涛老师惠赠；胎牛血清、RPMI-

1640 BPE、r-EGF的K-SFM培养液购自美国Gibco公司；miR-34c-5p mimic和miR-34c-5p对照序列购自中国锐博生物公司；脂质体2000和Trizol购自美国Invitrogen；逆转录试剂盒购自美国Promega公司；Real-time PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司；matrigel胶购自美国BD公司；6孔细胞培养板和Transwell细胞培养板购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组处理鼻咽癌细胞株HONE-1接种于10%胎牛血清含双抗的RPMI-1640培养液，正常鼻咽部细胞株NP69接种于含有BPE、r-EGF的K-SFM培养液，均置于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞培养至对数生长期。一部分细胞用于验证miR-34c-5p在鼻咽癌细胞株HONE-1和正常鼻咽部细胞株NP6中的表达量差异；另一部分设立miR-34c-5p mimic转染组、miR-34c-5p对照序列组和未处理组来确定miR-34c-5p表达对鼻咽癌细胞株HONE-1增殖、侵袭的影响。

1.2.2 定量PCR分析miR-34c-5p表达量利用Trizol法提取miR-34c-5p总RNA；利用逆转录试剂盒将总RNA逆转为cDNA，最后利用Real-time PCR试剂盒定量分析miR-34c-5p的表达情况。以RNU6b作为内参对照，样本靶miR-34c-5p含量以相对样品模板量即2△Ct表示，其中△Ct=Ct靶miRCtRNU6b。引物均由上海生工生物工程公司设计，见表1。

Tab.1Primer sequences for real time PCR of miR-34c-5p and U6表1 用于定量分析miR-34c-5p和U6表达的引物序列

1.2.3 miR-34c-5p mimic和对照序列转染以大约3×105个/孔，将HONE-1鼻咽癌细胞接种在6孔细胞培养平板内；细胞汇合达到70%～90%后，将细胞培养液换为无血清培养基（1 600 μL/孔）；miR-34c-5p mimic转染组加入400 μL miR-34c-5p mimic和脂质体2000复合物，miR-34c-5p对照序列组加入400 μL miR-34c-5p对照序列和脂质体2000复合物，轻轻混匀后，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育5 h；将转染液移出，更换含血清培养基继续培养24 h。

1.2.4 克隆形成能力分析取miR-34c-5p mimic转染组、miR-34c-5p对照序列组和未处理组对数生长期细胞，以约200个细胞/孔接种于6孔平板，置37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养10 d。倒去培养液，用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，拍照并计数细胞克隆团数。各组实验重复3次，计算各组算术平均数。

1.2.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力取40 μL稀释Matrigel加入小室中，37℃孵育2 h使Matrigel凝固；吸走小室中多余的液体，并在上室、下室分别加入100和600 μL无血清培养基，37℃平衡过夜；取miR-34c-5p mimic转染组、miR-34c-5p对照序列组和未处理组对数生长期细胞，计数1×105个细胞，用100 μL无血清DMEM培养基重悬，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培养基；在37℃、5%CO2孵育24 h，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤1次，结晶紫染色10 min，并拍照（×200）计数。各组实验重复3次，计算各组算术平均数。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，2组间均数比较采用t检验。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-34c-5p在鼻咽癌细胞株HONE-1和NP69中的表达miR-34c-5p在HONE-1中的表达水平低于NP69（2.49±0.81 vs 164.6±1.15，t=203.631,P＜0.05）。

2.2 上调miR-34c-5p对HONE-1克隆形成能力的影响miR-34c-5p mimic转染组、miR-34c-5p对照序列组和未处理组的克隆形成能力分别为56.33±6.51、92.33±6.81及94.00±12.17，差异有统计学意义（F=17.224,P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic转染组低于miR-34c-5p对照序列组和未处理组（均P＜0.05），后2组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

Fig.1The effect of up-regulating miR-34c-5p on the clone formation capacity of nasopharyngeal cancer cell line HONE-1图1 上调miR-34c-5p对鼻咽癌细胞HONE-1克隆形成能力的影响

2.3 上调miR-34c-5p对鼻咽癌细胞HONE-1侵袭能力的影响miR-34c-5p mimic转染组、miR-34c-5p对照序列组和未处理组的穿过小室的细胞数（单位：个）分别为46.67±8.39、90.00±22.91及93.33±24，差异有统计学意义（F=5.206，P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic转染组低于miR-34c-5p对照序列组和未处理组（均P＜0.05），后2组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

3 讨论

研究认为，鼻咽癌组织中的miR-34c-5p表达水平低于正常鼻咽部组织［4］。本研究证实，miR-34c-5p在鼻咽癌细胞株HONE-1中的表达水平低于正常鼻咽细胞株NP69。克隆形成实验和Tran⁃swell实验结果显示，miR-34c-5p mimic转染组克隆形成和细胞侵袭能力低于miR-34c-5p对照序列组和未处理组，表明上调miR-34c-5p的表达可明显抑制鼻咽癌细胞HONE-1的增殖和转移侵袭能力，提示miR-34c-5p的下调参与了鼻咽癌的增殖和转移侵袭功能特性。

同样与正常组织比较，miR-34c-5p在其他肿瘤中也呈较低表达水平，如直肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、喉癌等［5］。miR-34c-5p的下调与多种肿瘤的生物学功能如增殖、细胞周期进展、转移侵袭和放化疗抵抗性密切相关［6］。多种miR-34c-5p直接靶向基因如E2F3、BCL-2、c-MET、KITLG、cyclin-E等参与其抑癌作用。但在不同肿瘤中，参与miR-34c-5p抑癌的直接靶向基因有所不同［7-8］。因此，与鼻咽癌相关的miR-34c-5p直接靶向基因有待于进一步阐明。另外，与其他肿瘤不同，miR-34a在鼻咽癌中的表达未见异常，而miR-34c-5p、miR-34c-3p和miR-34b在鼻咽癌中的表达均降低［6］。这与miR-34b/c基因定位区域染色体11q23是鼻咽癌的常见缺失位点相一致，而且在此区域也发现多种与鼻咽癌相关的抑癌基因，如抑癌基因TSLC1（tumor sup⁃pressor in lung cancer）［9］。同时，有研究认为，启动子区域高甲基化是TSLC1在鼻咽癌中低表达的主要原因，与其在其他肿瘤低表达的相关机制一样，miR-34b/c在鼻咽癌中低表达与其基因启动子区域高甲基化有关［3］。鉴于miR-34家族各成员具有不同靶基因［10-11］，因此miR-34c-5p、miR-34c-3p和 miR-34b在鼻咽癌中的抑癌作用是否具有协同性以及相关的分子机制仍值得探索。

综上所述，miR-34c-5p下调参与了鼻咽癌的形成和进展，是鼻咽癌治疗的潜在靶点，miR-34c-5p和miR-34b在鼻咽癌形成和进展中的作用和相关分子机制仍需进一步阐明。

（图2见插页）

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（2015-01-23收稿 2015-05-12修回）

（本文编辑 陆荣展）

The effect of up-regulating miR-34c-5p on the proliferation and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1

MA Feifei1,HAO Yanqiang2,WANG Guoqiang3,ZHANG Xin4,ZHI Cheng5,JI Tianxing6△
1-3，5-6 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China；2 Guangdong Provincial Maternity and Child Care Center；4 The First People′s Hospital of Foushan△

ObjectiveTo investigate the effect of up-regulating miR-34c-5p on cloning formation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 in vitro.MethodsExpression levels of miR-34c-5p in nasopharyngeal cell line NP69 and nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 were investigated by real time quantitative PCR；Cloning Forma⁃tion Test and Transwell Migration Assay were used to explore the effect of up-regulating miR-34c-5p on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1.ResultsThe expression of miR-34c-5p in nasopharyngeal car⁃cinoma cell line HONE-1 was lower than that in normal nasopharyngeal cell line NP69.Up-regulating miR-34c-5p signifi⁃cantly suppressed the cloning formation and migration capacity,compared to those of NP69 cell line and HONE-1 with nor⁃mal level of miR-34c-5p（P＜0.05）.ConclusionDown-regulating miR-34c-5p involve in proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma and may be a used as a new therapeutic target for nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal neoplasms；cell proliferation；neoplasm invasiveness；in vitro；miR-34c-5p；HONE-1

R739.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.003

广州市医药卫生科技一般引导项目（2014A010074）；广州医学院科研基金项目（2012A08）

1广州医科大学附属第二医院VIP产科（邮编510260），3胃肠外科，5病理科，6检验科；2广东省妇幼保健院；4佛山市第一人民医院

马菲菲（1983），主治医师，硕士，主要从事肿瘤相关分子机制和临床分子诊断研究

△通讯作者E-mail：jitianxing7021@163.com