鲍曼不动杆菌外膜蛋白A的克隆表达及纯化

魏常梅，王俊瑞，孙 鹏，张军力

（1内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110；2内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古呼和浩特010050；3内蒙古医科大学病原生物学实验室，内蒙古呼和浩特010059）

·基础与转化医学·

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A的克隆表达及纯化

魏常梅1，王俊瑞2，孙 鹏3，张军力2

（1内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110；2内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古呼和浩特010050；3内蒙古医科大学病原生物学实验室，内蒙古呼和浩特010059）

目的：通过分子克隆方法制备鲍曼不动杆菌外膜蛋白A（OmpA）纯化蛋白，为进一步研究鲍曼不动杆菌OmpA蛋白的生物学活性提供基础．方法：首先采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606株外膜蛋白A编码基因（OmpA），构建其原核表达载体pET30a／ompA，所得产物经PCR方法和测序进行鉴定．之后筛选阳性表达载体，将其转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21，最后将表达的蛋白质进行纯化．结果：重组表达载体pET30a／ompA构建成功，并经PCR方法和测序方法进行鉴定；重组蛋白在所构建的原核表达系统中实现了高表达，纯化后得到了高纯度的OmpA蛋白．结论：本次试验通过分子克隆技术，使鲍曼不动杆菌OmpA蛋白在构建的原核表达系统中成功表达，并且获得了高纯度的目标蛋白，为进一步研究鲍曼不动杆菌外膜蛋白A的生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础．

鲍曼不动杆菌；外膜蛋白A；表达及纯化

0 引言

鲍曼不动杆菌是一种非发酵糖类、动力阴性、氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌，其广泛分布于自然界、医院环境以及人体表面，是引起医院感染的重要致病菌之一［1］．根据国家细菌监测网统计，我国不同地区医院中鲍曼不动杆菌检出率逐年增高，已成为临床感染疾病中的主要细菌．现如今，鲍曼不动杆菌对于亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗生素持续保持了较高的耐药率［2-6］．据文献报道，鲍曼不动杆菌外膜蛋白的表达情况与多种抗生素的抗性具有明显的相关性［7］．外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）是细菌肽聚糖外脂质双层镶嵌的特殊蛋白质，它被证实可以负责细菌代谢相关物质的运输、参与鲍曼不动杆菌耐药机制等，属于国内外相关研究领域的热点之一［8］．研究显示，外膜蛋白可以改变细菌外膜的通透性、改变抗生素结合靶位，还可以促进β-内酰胺酶的产生等［9-12］．OmpA不仅可以参与以上耐药机制，还与鲍曼不动杆菌毒力及致病性密切相关，其可以促进形成生物膜来保护细菌、结合宿主细胞表面的特定成分并侵入、诱导细胞凋亡等［13-16］．但鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白参与毒力产生的具体机制及其它生物学活性尚不明确．

本研究旨在通过分子克隆技术获取鲍曼不动杆菌OmpA纯化蛋白，以期进一步探索OmpA在鲍曼不动杆菌中的毒力表达情况及其具体生物学活性．

1 材料和方法

1．1 实验材料 细菌RNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒来自北京天根公司．DNA聚合酶购自BPI公司．RT-PCR试剂盒、反转录试剂盒、内切酶来自大连宝生物有限公司．质粒pET30a来自Novagen公司．BL21感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司．

1．2 实验器材 高速冷冻离心机来自HITACHI CR-21GIII公司．VITEK-32全自动微生物分析鉴定仪来自法国梅里埃公司，基础电泳仪、电泳槽、来自BIO-RAD公司，Tanon-1600凝胶成像仪来自Tanon公司．

1．3 实验方法

1．3．1 OmpA基因扩增鲍曼不动杆菌RNA提取首先复苏鲍曼不动杆菌临床分离株ATCC19606株，之后常规培养18～24 h，将菌液12 000 r／min，离心2 min收集菌体，用含有400 mg／L溶菌酶的100 μL TE缓冲液悬浮菌体．加入350 μL裂解液RL，震荡混匀，12 000 r／min，离心2 min．将得到的上清转移至另一EP管，加入250 μL无水乙醇，混匀，将溶液沉淀一起转入吸附柱CR3，12 000 r／min，离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管．加入350 μL去蛋白液RW1，12 000 r／min，离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管．DNase I工作液的配置：将10 μLDNase I储存液加入新的RNase-Free离心管中，之后放入70 μL RDD溶液，混匀．向CR3加入80 μLD-Nase I工作液，置于室温15 min．加入350 μL去蛋白液RW1，12 000 r／min，离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管．之后加入500 μL漂洗液RW，室温2 min，12 000 r／min，离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管．重复清洗一次．12 000 r／min，离心2 min，弃去废液，室温晾置数分钟．转入新的RNase-Free离心管，吸附膜中间悬空滴加100 μLRNase-Free ddH2O，室温2 min，12 000 r／min，离心2 min，得到RNA溶液．

反转录．配置RT反应液：4 μL 5×PrimeScript RT Master Mix，16 μL RNA溶液．反应程序：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃．将RNA转录为cDNA，-80℃保存．

设计引物及合成．采用 Genbank中的EWO26642．1基因序列设计并合成引物，设计的引物序列为，F：GGAATTCTTCCAAGACAGCCAACACAA-CAAT，R：CCGCTCGAGTTGAGCTGCTGCAGGAGCT-GCC．合成由上海生工生物工程有限公司完成．

PCR．反应体系：1 μL模板，3 μL dNTP（2．5 mmol／L stock），5 μL Buffer（10X），0．2 μL引物F， 0．2 μL引物R，0．2 μL（5unit／μL）聚合酶（Taq DNA Polymerase，BPI），37．5 μL ddH2O．反应程序：95℃，5 min；95℃，40 s，56℃，40 s，72℃，1 min，共30个循环；72℃，10 min．

PCR产物回收．将目的基因DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管、称质量．加入等倍体积溶液PN，50℃水浴至胶块完全溶解．将所得溶液加入500 μL平衡液BL处理的吸附柱CA2中，室温5 min，12 000 r／min，离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管．加入600 μL漂洗液PW，12 000 r／min，离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管．重复清洗一次．12 000 r／min，离心2 min，弃去废液，室温晾置数分钟．转入新的离心管，吸附膜中间悬空滴加30 μL ddH2O，室温5 min，12 000 r／min，离心2 min，得到DNA溶液．

1．3．2 构建重组质粒及其验证 目的片段的酶切．20 μL PCR回收产物，2 μLEcoR I，2 μLXho I，5 μL 10 ×Buffer，37℃孵育过夜．采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将酶切产物回收．

载体的酶切．20 μL载体（pET30a）质粒2 μL EcoR I，2 μL Xho I，5 μL 10×Buffer，37℃孵育过夜．采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将酶切的载体回收．

连接及转化．连接体系：3 μL酶切回收产物，1 μL载体（pET30a），5 μL的2×Rapid Buffer，1 U T4 DNA Ligase，混匀后置于16℃孵育过夜．转化：取出100 μL保存于-80℃的感受态细胞（BL21）置于冰上缓慢解冻．感受态细胞解冻后将连接产物加入并混匀，在0℃冰水混合物中放置30 min．快速移入42℃水浴锅中热激90 s．之后0℃冰浴2 min，再加入800 μL无任何抗性的 LB液体培养基．混匀后在37℃水浴箱震荡培养45～60 min．之后5 000 r／min离心3 min，弃上清，留取约100～150 μL液体，吹打混匀重新悬浮菌体，将菌液涂布于有相应抗性的LB平板．待平板晾干，置于37℃培养箱倒置过夜培养．

菌液PCR验证．挑取转化平板上的单个菌落于1 mL相应抗性的液体LB中，37℃摇床培养4 h；各取1 μL进行PCR验证，体系如下：1 μL模板，1 μL引物F，1 μL引物R，7 μL ddH2O，10 μL 2X Taq mix-ture．反应程序：95℃，5 min；95℃，40 s，56℃，40 s，72℃，1 min，共30个循环；72℃，10 min．

小量表达．由转化的平板中挑取单个克隆接种到1．5 mL的LB液体培养基中，置于37℃摇床，200 r／min进行培养．将其培养至A＝0．6时，IPTG（0．5 mmol／L）诱导，之后37℃，200 r／min培养2 h．取出诱导后的菌液1 mL，12 000 r／min将其离心1 min，弃去上清，再用50～100 μL 10 mmol／L Tris-HCl（pH 8．0）溶液将沉淀吹散，之后加入缓冲液等体积的2× loading buffer，置于100℃煮沸5 min，最后电泳进行检测．

细菌基因的PCR及测序验证．采用天根公司的细菌DNA提取试剂盒提取阳性克隆菌的DNA，之后用下述验证引物进行PCR．PCR里所用的引物与上述“1．3．1”中PCR扩增所用引物相同．得到的PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行基因测序．将测序所得结果在NCBI blast数据库中进行对比、分析．

1．3．3 重组蛋白大量表达及其纯化 蛋白的大量表达．挑选经过验证的正确菌株，接1～2 μL活化的菌液到10 mL LB液体培养基中，置于37℃，200 r／min培养．将培养得到的菌液转接至500 mL LB液体培养基并混匀，之后37℃，200 r／min进行，将其培养至A＝0．6时，再IPTG（0．5 mmol／L）诱导4 h．将诱导后的菌体收集：6 000 r／min，离心5 min．弃去上清．之后进行超声破菌：用25 mL 10 mmol／L Tris-HCl（pH8．0）溶液将沉淀吹散，再超声．进行电泳确定其表达形式：取菌液100 μL进行超声（500 W，90次，每次3 s，间隔6 s），将超声后的菌悬液12 000 r／min，离心10 min，再取50 μL上清液转移至另一EP管，将上清除去，剩余的沉淀用50 μL 10 mmol／L Tris-HCl（pH8．0）溶液将其吹散，之后加入50 μL 2×loading buffer，置于100℃煮沸5 min，最后进行电泳．

蛋白的纯化．用去离子水洗镍柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare），至其pH调至7．0．之后进行挂镍，至pH2～3．用去离子水洗柱至pH7．0．加入10 mmol／L Tris-HCl（pH8．0）溶液平衡镍柱，大约100 mL．再用含0．5 mol／L氯化钠的10 mmol／L Tris-HCl（pH8．0）溶液平衡镍柱，约50 mL．之后稀释样品进行上样．样品中含氯化钠，使其终浓度为0．5 mol／L．上样结束后，用含0．5 mol／L氯化钠的10 mmol／L Tris-HCl（pH8．0）溶液洗柱．再分别用含15 mmol／L咪唑、60 mmol／L咪唑、300 mmol／L咪唑的10 mmol／L Tris-HCl（pH8．0）（含0．5 mol／L氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰．最后电泳检测蛋白纯化效果．

2 结果

2．1 目的基因序列 在PubMed数据库中检索鲍曼不动杆菌外膜蛋白A的蛋白信息，得到其基因序列．TTCCAAGACAGCCAACACAACAATGGCGGTAAAGA TGGTAACTTAACTAACGGTCCTGAGTTACAAGACGA TTTATTCGTTGGCGCAGCTCTTGGTATCGAGTTAACT CCATGGTTAGGTTTCGAAGCTGAATATAACCAAGTT AAAGGCGACGTAGACGGCGCTTCTGCTGGTGCTGA ATATAAACAAAAACAAATCAACGGTAACTTCTATGT TACTTCTGATTTAATTACTAAAAACTACGACAGCAA AATCAAGCCGTACGTATTATTAGGTGCTGGTCACTA TAAATACGACTTTGATGGCGTAAACCGTGGTACACG TGGTACTTCTGAAGAAGGTACTTTAGGTAACGCTGG TGTTGGTGCTTTCTGGCGCTTAAACGACGCTTTATCT CTTCGTACTGAAGCTCGTGCTACTTATAATGCTGATG AAGAGTTCTGGAACTATACAGCTCTTGCTGGCTTAAA CGTAGTTCTTGGTGGTCACTTGAAGCCTGCTGCTCCT GTAGTAGAAGTTGCTCCAGTTGAACCAACTCCAGTT GCTCCACAACCACAAGAGTTAACTGAAGACCTTAA CATGGAACTTCGTGTGTTCTTTGATACTAACAAATCA AACATCAAAGACCAATACAAGCCAGAAATTGCTAAA GTTGCTGAAAAATTATCTGAATACCCTAACGCTACTG CACGTATCGAAGGTCACACAGATAACACTGGTCCAC GTAAGTTGAACGAACGTTTATCTTTAGCTCGTGCTAA CTCTGTTAAATCAGCTCTTGTAAACGAATACAACGTT GATGCTTCTCGTTTGTCTACTCAAGGTTTCGCTTGGG ATCAACCGATTGCTGACAACAAAACTAAAGAAGGTC GTGCTATGAACCGTCGTGTATTCGCGACAATCACTG GTAGCCGTACTGTAGTAGTTCAACCTGGTCAAGAAG CGGCAGCTCCTGCAGCAGCTCAA

2．2 目的基因PCR扩增 鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606株OmpA基因经PCR扩增后所得片段（1 000 bp）（图1）．PCR扩增的片段大小和预期的片段大小相一致．

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

2．3 菌液PCR验证 载体和目的片段双酶切并连接、转化后的菌液PCR验证结果见图2．菌液扩增片段大小与目的片段大小一致．

2．4 构建重组质粒成功后蛋白小量表达结果 将构建的重组质粒进行小量表达，可检测到与预期大小一致的目的蛋白（图3）．

图2 菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

2．5 重组质粒PCR验证及测序鉴定 经过PCR验证和测序鉴定，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示与预期大小片段一致的基因片段（图4），PCR产物1 000 bp．将产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果部分图谱见图5．将测序结果与NCBI数据库序列进行比对，其同源性为 100%（图6）．

图3 小量表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果

图4 插入序列PCR验证结果

图5 OmpA插入片段测序部分图谱

图6 插入序列同源性比对结果

2．6 目的蛋白在菌体中的大量表达 目的蛋白经过大量表达后再进行SDS-PAGE观察，结果显示与预期大小蛋白的表达相一致（图7）．

2．7 纯化蛋白的表达 目的蛋白经纯化后蛋白电泳结果显示了与预期大小一致的蛋白表达（图8）．

3 讨论

图7 大量表达目的蛋白SDS-PAGE电泳结果

鲍曼不动杆菌OmpA是目前研究领域里最为深入的外膜蛋白之一．多项研究显示，鲍曼不动杆菌已经成为全球院内感染的主要形式，由于其抵抗几乎所有的常规抗生素，现在被美国传染病学会列为危险六个微生物之一［17-18］．有研究发现，鲍曼不动杆菌OmpA基因的缺失会导致氯霉素、氨曲南和萘啶酸等药物的最小抑菌浓度值［12］．OmpA是鲍曼不动杆菌的主要非特异性通道，会使细菌整个外膜的渗透性减低．该蛋白的低渗透连同β内酰胺酶构成和多种药物外排泵同时存在，是多种抗生素高耐药必不可少的机制［19］．OmpA蛋白被认为是静脉感染后鲍曼不动杆菌体液免疫应答主要靶标［20］，可以将外膜锚定到细胞壁［21］，与真核细胞相互作用，诱导其凋亡．但是，鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白其他具体的生物学活性尚不明确．因此，本研究旨在初步构建OmpA重组蛋白，便于今后更好地探讨OmpA蛋白的生物学活性及其具体致病机制．

图8 蛋白纯化后电泳结果

本研究从鲍曼不动杆菌临床分离株中成功克隆了OmpA基因，并采用原核表达载体pET30a对Om-pA基因进行表达．本次实验中通过双酶切与载体pET30a成功重组．之后，采用PCR方法验证得到与预期大小一致的基因片段，其基因测序结果表明目的基因片段与GenBank中鲍曼不动杆菌菌株OmpA基因一致性高达100%，证实了本研究所选菌株OmpA基因与比对序列高度同源，也说明了该基因具有高度保守性．经大肠杆菌诱导表达目的蛋白，验证结果显示该蛋白相对分子质量为50 kD左右，与预期结果一致．但由于本研究所获得重组蛋白含量有限，关于鲍曼不动杆菌OmpA蛋白其他具体的生物学活性尚不能确定，有待进一步扩大样本量进行验证．

综上所述，本研究采用基因重组的方法成功获得了高纯度的鲍曼不动杆菌OmpA重组蛋白，并采用PCR方法和基因测序方法进行验证，为进一步研究OmpA蛋白在鲍曼不动杆菌生物学活性以及致病机制奠定了基础．

［1］习慧明，徐英春，朱德妹，等．2010年中国CHINET鲍曼不动杆菌耐药性监测［J］．中国感染与化疗杂志，2012，12（2）：98-104．

［2］胡付品，朱德妹，汪 复，等．2013年中国CHINET细菌耐药性监测［J］．中国感染与化疗杂志，2014，14（5）：365-374．

［3］孟 峻，张军力，王俊瑞，等．鲍曼不动杆菌感染的临床分布及耐药性分析［J］．内蒙古医科大学学报，2014，36（4）：293-296．

［4］Garcia-Quintanilla M，Pulido MR，McConnell MJ．First steps to-wards a vaccine against Acinetobacter baumannii［J］．Curr Pharm Biotechnol，2013，14（10）：897-902．

［5］张 辉，张小江，徐英春，等．2012年中国CHINET不动杆菌属细菌耐药性监测［J］．中国感染与化疗杂志，2014，14（5）：392 -397．

［6］李光辉，朱德妹，汪 复，等．2012年中国CHINET血培养临床分离菌的分布及耐药性［J］．中国感染与化疗杂志，2014，14（6）：474-481．

［7］吴春阳，钱雪峰，张险峰，等．多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵基因和外膜蛋白基因的检测［J］．临床检验杂志，2013，31（7）：531-534．

［8］温顺航，李昌崇．鲍曼不动杆菌外膜蛋白研究进展［J］．国际呼吸杂志，2011，31（19）：1512-1515．

［9］Doi Y，Murray GL，Peleg AY．Acinetobacter baumannii：evolution of antimicrobial resistance-treatment options［J］．Semin Respir Crit Care Med，2015，36（1）：85-98．

［10］Gaddy JA，Tomaras AP，Actis LA．The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA Protein Plays a Role in Biofilm Formation on Abiotic Surfaces and in the Interaction of This Pathogen with Eukaryotic Cells［J］．Infect Immun，2009，77（8）：3150-3160．

［11］刘青松，孙静娜，代丽丽，等．鲍曼不动杆菌的耐药机制研究进展［J］．中国微生态学杂志，2015，27（1）：108-111．

［12］Smani Y，Fàbrega A，Roca I，et al．Role of OmpA in the multidrug resistance phenotype of Acinetobacter baumannii［J］．Antimicrob A-gents Chemother，2014，58（3）：1806-1808．

［13］Moon DC，Choi CH，Lee JH，et al．Acinetobacter baumannii outer membrane protein A modulates the biogenesis of outer membrane ves-icles［J］．J Microbiol，2012，50（1）：155-160．

［14］Park JS，Lee WC，Choi S，et al．Overexpression，purification，crys-tallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of the periplasmic domain of outer membrane protein A from Acinetobacter baumannii［J］．Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun，2011，67（Pt 12）：1531-1533．

［15］Jin JS，Kwon SO，Moon DC，et al．Acinetobacter baumannii Se-cretes Cytotoxic Outer Membrane Protein A via Outer Membrane Ves-icles［J］．PLoS One，2011，6（2）：e17027．

［16］Choi CH，Lee JS，Lee YC，et al．Acinetobacter baumannii invades epithelial cells and outer membrane protein A mediates interactions with epithelial cells［J］．BMC Microbiol，2008，8：216．

［17］Baig A，Cabral TM，Corbett CR．Development and characterization of monoclonal antibodies for rapid detection of Acinetobacter bau-mannii［J］．Monoclon Antib Immunodiagn Immunother，2014，33（4）：291-298．［18］Chiang MH，Sung WC，Lien SP，et al．Identification of novel vac-cine candidates against Acinetobacter baumanniiusing reverse vaccin-ology［J］．Hum Vaccin Immunother，2015，11（4）：1065-1073．

［19］Sugawara E，Nikaido H．OmpA Is the Principal Nonspecific Slow Porin of Acinetobacter baumannii［J］．J Bacteriol，2012，194（15）：4089-4096．

［20］Luo G，Lin L，Ibrahim AS，et al．Active and passive immunization protects against lethal，extreme drug resistant-Acinetobacter bauman-nii infection［J］．PLoS One，2012，7（1）：e29446．

［21］Park JS，Lee WC，Yeo KJ，et al．Mechanism of anchoring of OmpA protein to the cell wall peptidoglycan of the gram-negative bacterial outer membrane［J］．FASEB J，2012，26（1）：219-228．

Cloning expression and purification of Acine-tobacter baumannii outer membrane protein A

WEI Chang-Mei1，WANG Jun-Rui2，SUN Peng3，ZHANG Jun-Li21
Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China；2Clinical Laboratory，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medi-cal University，Hohhot 010050，China；3Pathology laboratory，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010059，China

AIM：To provide a basis study for the biological ac-tivity of Acinetobacter baumannii outer membrane protein A（Om-pA）in Acinetobacter baumannii by preparing purified OmpA with molecular cloning technology．METHODS：PCR method was used toamplifycoded geneofOmpA ofstandard strains ATCC19606，and construct the prokaryotic expression vector pET30a／ompA．The roducts were verified by PCR method．Then the positively expressed vector was selected and was transformed into Escherichia coli expression strain（BL21 strain）．The ex-pression products were purified finally．RESULTS：pET30a／om-pA recombination expression vector was successfully constructed and verified by PCR method．The target protein was highly ex-pressed in prokaryotic expression system，and the ideal OmpA of Acinetobacter baumannii was obtained．CONCLUSION：In this experiment，Acinetobacter baumannii outer membrane protein A gene was successfully expressed in the constructed prokaryotic ex-pression system by molecular cloning technology and the highly purified target protein，which provide a basis for further investiga-ting the biological activities of Acinetobacter baumannii OmpA protein and the protective effects of its polyclonal antibody．

Acinetobacter baumannii；outer membrane protein A；expression and purification

R378

A

2095-6894（2015）05-001-06

2015-04-01；接受日期：2015-04-10

内蒙古自然科学基金（2013MS1127）

魏常梅．在读硕士．E-mail：weichangmei1234＠163．com

张军力．E-mail：junli0099＠sina．com