结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究

林媛，朱宁屿，蒋建东，司书毅

结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究

林媛，朱宁屿，蒋建东，司书毅

目的 筛选结核分枝杆菌 FtsZ的特异性抑制剂，为抗结核药物的研发提供先导化合物。

方法 应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂筛选模型对化合物库进行筛选，获得能够抑制 FtsZ的化合物 202E，对其进行 IC50以及分子水平活性测定，并利用 DS 4.0软件将化合物 202E与 FtsZ的活性位点进行对接。

结果 化合物 202E能够抑制结核分枝杆菌 FtsZ的 GTP酶活性，其 IC50为15.46 μmol/L。202E还能够抑制 FtsZ蛋白的聚合。通过分子对接，发现 202E能够与 FtsZ的GTP结合位点结合，抑制 FtsZ的 GTP酶活性。

结论 化合物 202E是活性较好的结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂。

结核分枝杆菌； 酶抑制剂； FtsZ

结核病近年来在全球范围有卷土重来的趋势，主要原因是多重耐药结核杆菌（MDR）的出现以及结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒（HIV）的联合感染。在过去的几十年中，几乎没有新型高效的抗结核药物被研发出来［1］。直到 2012年底，美国FDA批准二芳基喹啉上市，虽然其具有抗结核活性，但是体内毒性较大［2］。因此，寻找新的有效的抗结核药物成为我国乃至世界结核病防治的重要任务。

细菌结构蛋白 FtsZ是真核细胞微管蛋白类似物。细胞分裂时，在 GTP存在下，FtsZ在细胞内膜中心聚合成多聚体，形成高度螺旋结构 Z环［3-4］。之后，在其他分裂蛋白的参与下，使 Z环逐渐缩小导致隔膜形成，最终导致细胞分裂。FtsZ在包括结核分枝杆菌在内的原核细胞分裂过程中都发挥着重要的作用，并且几乎所有原核细胞的 FtsZ都是高度保守的，因此，以 FtsZ为靶点的药物能够抑制多种病原微生物。同时，原核细胞的 FtsZ与真核生物的同种功能蛋白之间有较大差异，因此，FtsZ被认为是一个很好的抗结核药物研究靶点［5-6］。

本研究以 FtsZ为靶点，利用前期工作中建立的结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂筛选模型［7］，对国家新药（微生物）筛选实验室化合物库进行筛选，寻找到结构新颖的抗结核先导化合物，为抗结核药物的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 带有 FtsZ基因的表达工程菌pET16b-FtsZ（BL21）由本室构建；耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）mc2155购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。

1.1.2 试剂与培养基 孔雀绿、GTP、DMSO购自美国 Sigma公司；30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、4×分离胶缓冲液、4×浓缩胶缓冲液、R-250考马斯亮蓝染色液购自北京普利莱基因技术有限公司；7H9培养基、ADC增菌液购自美国 BD公司；化合物 202E购自北京百灵威科技有限公司；筛选所用化合物库来自国家新药（微生物）筛选实验室，纯度 ＞95%。

1.1.3 仪器 EnVision2014型酶标仪为美国PerkinElmer公司产品。

1.1.4 对接软件 Discovery Studio（DS）4.0购自美国Accelrys公司。

1.2 方法

1.2.1 耻垢分枝杆菌对化合物库进行初筛 由于结核分枝杆菌生长速度过慢，无法满足大量的体外筛选要求，因此我们选择与结核分枝杆菌高度同源的耻垢分枝杆菌 Mycobacterium smegmatis mc2155作为体外筛选的模式菌（结核分枝杆菌 H37Rv与耻垢分枝杆菌 Mycobacterium smegmatis mc2155 的 FtsZ蛋白相似性达 95%），对化合物库 2万个样品进行初步筛选。筛选方法如下：耻垢分枝杆菌用 7H9培养基（含 10%ADC增菌液）培养，接种于 96微孔板中，接菌量为 5×105cfu/ml，每孔200 μl。化合物库的筛选终浓度为 10 μg/ml。37℃培养 24 h观察结果。将抑制耻垢分枝杆菌生长的化合物建立初筛阳性库。

1.2.2 以结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂筛选模型筛选初筛阳性库 利用之前构建的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂筛选模型对初筛阳性库进行筛选，方法同文献［7］：待测的化合物样品终浓度为 10 μg/ml，与 FtsZ（12µmol/L）蛋白室温孵育 30 min，之后加入 GTP（1 mmol/L），在 37℃ 孵育 15 min。缓冲液选用 50 mmol/L Tris，5 mmol/L MgCl2，pH 7.5。加入 200µl酸性溶液终止反应，该酸性溶液的成分包括 0.045%（W/V）孔雀绿，4.2%钼酸铵（溶于 4 mol/L HCl），5‰（V/V）浓 HCl。用酶标仪检测 650 nm处的吸光值。同时设立空白对照：以不加 FtsZ为阳性对照（即酶活性完全被抑制），以等体积的DMSO为阴性对照（即未加抑制剂）。

其中，△FN是阴性对照孔吸光值；△FS是样品实验孔吸光值；△FP是阳性对照孔吸光值。以抑制率 ＞50%为阳性。

1.2.3 活性化合物 IC50测定 将筛选得到的活性化合物 202E溶于 DMSO中，配置成 10 mg/ml（22 mmol/L）的母液。之后将化合物倍比稀释，按照文献［7］分别获得不同浓度条件下的抑制率，以抑制剂浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，利用 graphpad prism5软件计算 IC50。

1.2.4 蛋白水平检测活性化合物对 FtsZ多聚体形成的影响 FtsZ蛋白用聚合缓冲液（50 mmol/LMES、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L KCl，pH 6.5）溶解至浓度为 5µmol/L，加入不同浓度（25、50、100μmol/L）活性化合物 202E，同时加入 1 mmol/L GTP，在 25℃ 孵育 10 min，287 000×g高速离心 30 min，取沉淀样品，跑 SDS-PAGE电泳。比较加入阳性化合物前后 FtsZ多聚体形成的量。

1.2.5 活性化合物对耻垢分枝杆菌的 MIC测定 在 96微孔板中进行，耻垢分枝杆菌用 7H9培养基（含 10%ADC增菌液）培养，接菌量为5×105cfu/ml，每孔 200 μl。化合物的终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/ml（0.7、1.4、2.75、5.5、11、22 μmol/L）。37℃ 培养 24 h观察结果。

1.2.6 活性化合物与 FtsZ蛋白活性位点的对接 采用 Discovery Studio4.0软件进行分子对接。从 PDB数据库中下载 FtsZ的 PDB（ID：2Q1Y）文件，进行预处理，去水，加氢，处理蛋白，以补充文件中氨基酸残基。将 FtsZ定义为受体，定义GTP结合位点和找到结合空腔，然后定义结合球，确定结合区域坐标。对接时，采用 CDOOKER程序，将 FtsZ定义为受体，202E定义为配体，选择结合区域坐标，运行程序。完成后，可在结果中获得结合能、形成键等多项参数。

2 结果

2.1 耻垢分枝杆菌初筛阳性库结果

用耻垢分枝杆菌对化合物库 2万个样品进行筛选，共得到 65个初筛阳性化合物，建立初筛阳性库。

2.2 结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂筛选模型筛选结果

用结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂筛选模型对初筛阳性库进行筛选，抑制率 ＞50%则认为阳性。共得到 3个对结核分枝杆菌 FtsZ有抑制作用的化合物。其中抑制率较高的为 202E，结构见图 1。

图1 化合物 202E的结构Figure 1 Structure of compound 202E

2.3 阳性化合物 202E IC50的测定

化合物 202E对FtsZ的 GTP酶活性抑制作用如图 2所示。随着 202E浓度的增高，对 FtsZ 的 GTP酶活性抑制作用越来越强，表现出明显的剂量依赖性。通过用软件 graphpad prism5拟合曲线得知，202E对 FtsZ的 GTP酶IC50约为15.46 μmol/L。

图2 化合物 202E对 FtsZ IC50的测定Figure 2 IC50of GTPase activity of FtsZ by 202E

2.4 化合物 202E对 FtsZ多聚体形成的影响

FtsZ蛋白单体在 GTP存在的情况下可以聚合成 FtsZ多聚体，而 FtsZ多聚体再进一步聚合就可以形成细胞分裂过程中的隔板。经过检测，如图 3所示，未加入化合物的 FtsZ在含有 GTP的聚合缓冲液中，发生了明显的聚合。对照为未加入GTP的 FtsZ，没有明显的聚合现象。而随着 202E浓度的增高，形成的 FtsZ聚合物逐渐减少。提示化合物 202E抑制了 FtsZ的聚合。

2.5 化合物 202E对耻垢分枝杆菌活性测定

经测定，化合物 202E有抗耻垢分枝杆菌活性，其 MIC为 2.5 μg/ml（5.5 μmol/L）。

2.6 化合物 202E和结核分枝杆菌 FtsZ活性位点的对接

评价分子间相互作用通常以能值作为评判标准。能值的负绝对值越大，证明受体与底物的对接亲和力越大，同时也预测了小分子与受体结合的活性也越高［8］。经过软件分析，化合物 202E与结核分枝杆菌 FtsZ蛋白间相互作用的能值为160.52 kJ/mol。对接分析结果表明，化合物 202E与FtsZ的 GTP结合位点的结合主要是靠氢键结合力，这也是小分子与蛋白间相互作用的主要结合键。图 4A显示的是 202E与 FtsZ蛋白 GTP结合区的结合位置。图 4B给出参与 202E和 FtsZ相互作用的氨基酸和形成的氢键。

图3 SDS-PAGE电泳结果显示 202E抑制 FtsZ的聚合Figure 3 SDS-PAGE shows the inhibition of FtsZ polymers by 202E

图4 化合物 202E与 FtsZ的对接结果（化合物 202E以杆状结构表示，参与小分子相互作用的氨基酸标注氨基酸编号，红色表示氢键。A：化合物 202E对接入 FtsZ的位置；B：化合物 202E与 FtsZ形成的键）Figure 4 Docking result of compound 202E and FtsZ（Compound 202E was shown in rod structure.The interaction amino acids were labeled with serial number.Hydrogen bond was indicated with red.A:The position of compound 202E inserted into FtsZ；B: The bonds of compound 202E and FtsZ）

3 讨论

本实验利用已建立的结核分枝杆菌 FtsZ抑制剂的筛选模型筛选抗结核先导化合物，得到一个阳性化合物 202E。202E可以在酶水平抑制结核分枝杆菌 FtsZ的 GTP酶活性，也可以在蛋白水平抑制 FtsZ的聚合。分子对接显示，202E可以与 FtsZ蛋白的 GTP结合位点形成相互作用键，阻碍 FtsZ 与 GTP结合之后发挥生物学功能。活性化合物202E未在之前的文献中报道有抗结核活性。

Discovery Studio（简称 DS）是新型的以生物大分子、有机小分子为主要研究对象的专业分子模拟与设计软件。主要功能包括：同源建模、分子动力学模拟、基于结构药物设计工具（包括配体-蛋白相互作用、全新药物设计和分子对接）、基于小分子的药物设计工具（包括定量构效关系、药效团、数据库筛选、ADMET），应用学科涵盖生命科学、组合化学、药物化学、计算化学等。分子对接就是把配体分子放在受体活性位点的位置，然后按照几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则来实时评价配体与受体相互作用的好坏，并找到两个分子之间最佳的结合模式。新药的研发是一个漫长的过程，如果每一个新化合物都进行药理实验研究，将浪费很多的人力、物力、财力。计算机辅助药物设计的建立，开拓了新的药物研究领域和方法，从分子水平研究药物与受体的相互作用。为后续实验研究提供重要的信息，使实验研究具有较强的导向性［9-10］。

本研究为以 FtsZ为靶点的抗结核药物研究提供了较好的分子探针。在后续实验中，会进一步测定活性化合物的抗结核作用和对其他微生物的抗菌作用，以及开展体内、外药效学研究。我们还将对活性化合物继续进行结构改造，进行深入的构效关系、分子药理学研究，以期获得结构新颖、效果显著的新型抗结核药物先导物。

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Methods By using the high-throughput screening model for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ，compound 202E was selected.We assessed the IC50value and molecular level activity of 202E.And then we docked compound 202E with active site of FtsZ.

Results Compound 202E was found to inhibit GTPase activity of Mycobacterium tuberculosis FtsZ with IC50of 15.46 μmol/L. 202E also reduce the polymers of FtsZ.Molecular docking showed that 202E bound to the GTP site of FtsZ and inhibited the GTPase activity of FtsZ.

Conclusion Compound 202E is a promising lead for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.

Screening and activity of Mycobacterium tuberculosis FtsZ inhibitors

LIN Yuan，ZHU Ning-yu，JIANG Jian-dong，SI Shu-yi

Objective The aim of the study is to find new anti-tuberculosis agents which can inhibit the activity of FtsZ in Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis；Enzyme inhibitors；FtsZ

SI Shu-yi，Email:sisyimb@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.003

国家自然科学基金（81302816）

100050北京，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室（林媛、蒋建东）；中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室（朱宁屿、司书毅）

司书毅，Email：sisyimb@hotmail.com

2014-09-02

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术，2015，10（2）:109-112

Author Affiliations:Institute of Materia Medica（LIN Yuan，JIANG Jian-dong），Institute of Medicinal Biotechnology（ZHU Ning-yu，SI Shu-yi），ChineseAcademy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:109-112