固态发酵法降解油茶粕中单宁的研究

刁欢，汤强，廖应升 （安徽新华学院药学院，安徽 合肥230088）

油茶是我国南方地区的一种木本油料作物，油茶粕是油茶经榨油后的残渣，是一种营养价值较高的工业副产品。油茶粕营养成分丰富，主要有粗蛋白（10%～15%），粗脂肪（5%），糖类（30%～40%）、粗纤维（15%～20%）和水分（14%），以及对动物生长发育有利的必需微量元素 Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu［1］。因此，油茶粕是一种优良的天然植物蛋白资源，可作为优质的蛋白饲料源。然而，由于油茶粕中含有茶皂素、单宁等多种抗营养因子，从而限制了其在饲料中的应用。

单宁（Tannin）又称单宁酸（Tannic acid）、鞣质，是一种广泛存在于植物体内的多元酚类化合物的统称，其相对分子质量一般为500～3000。由于单宁味苦涩影响饲料的适口性，从而降低了动物摄食率［2］。过量的单宁还可降低蛋白质、氨基酸的消化率，并损伤肠壁，进而影响动物的生长发育［3］；再者，单宁可与消化道黏膜蛋白结合，形成不溶性复合物排出体外，增加了内源氮的排泄量。研究表明，单宁酶可水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，且单宁酶属于诱导酶，主要利用微生物发酵生产获得［4，5］。因此，通过微生物发酵的方法产生单宁酶，促进单宁的有效生物降解，是生产中将油茶粕转化为优质蛋白质饲料源的关键。本研究拟采用发酵过程中可产生单宁酶、发酵能力强的黑曲霉和酵母菌作为菌种［6，7］，从温度、pH、发酵时间等因素出发，研究微生物固态发酵中单宁酶产生和单宁降解的最佳条件，并将单宁含量调控到对动物体有益的范围［8］，以期为油茶粕作为蛋白质饲料源使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 菌种

黑曲霉、酵母菌购于中国工业菌种保藏中心。

1.1.2 固态发酵培养基

油茶粕培养基：油茶粕13g、可溶性淀粉1g、尿素1.5g、磷酸氢二钠0.05g、七水硫酸镁0.015g、牛肉膏0.2g、七水硫酸亚铁0.03g、酵母膏0.5g、蒸馏水100mL，自然pH，121℃灭菌20min。

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、自来水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。

1.1.3 种子液的培养

酵母种子液的培养：将酵母菌从斜面培养基接种至装有50mL麦芽汁液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、160r／min培养24h。

霉菌种子液的培养：将霉菌从斜面培养基接种至装有50mLPDA液体种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、160r／min培养24h。

混菌按照接菌比例1∶1。

1.1.4 主要仪器设备

DA－180M型显微镜、AL204型电子天平、PHS－3C精密酸度计、HH－S型水浴锅、Lac－5060S灭菌锅、Lab－Tech SPX智能型培养箱、HZQ－QG型振荡器、721型分光光度计。

1.2 发酵条件优化方法

1.2.1 发酵时间的优化

取培养基中的菌液，以10%的接种量接种于油茶粕培养基中，在恒温30℃、pH 5的条件下进行培养，分别在发酵1、2、3、4、5、6d后取样测定单宁的含量。设置未接菌种的油茶粕培养基作为对照组，每个处理3个重复。

1.2.2 pH的优化

取培养基中的菌液，以10%的接种量接种于油茶粕培养基中，恒温30℃下，分别在pH为3、4、5、6、7、8条件下发酵3d后取样测定单宁含量，设置未接菌种的油茶粕培养基作为对照，每个处理3个重复。

1.2.3 发酵温度的优化

取培养基中的菌液，以10%的接种量接种于油茶粕培养基中，自然pH（pH 6.6～7.0）下，分别在10、15、20、25、30℃和35℃下发酵3d后取样测定单宁含量，设置未接菌种的油茶粕培养基（发酵温度30℃）作为对照，每个处理3个重复。

1.3 单宁的测定

单宁含量的测定方法采用分光光度法，参照林业行业标准《单宁酸分析试验方法》（LY／T 1642－2005）［9］进行。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时间对不同菌种发酵的油茶粕中单宁含量的影响

随着发酵时间从1d逐渐增加到6d，不同菌种对油茶粕中单宁的分解能力呈现先升高后降低趋势，其中混菌发酵油茶粕单宁含量在3d时降低到最小值0.52%（占油茶粕总量的比例），但随着发酵时间延长至4～6d后，3个处理之间无显著差异（P＞0.05）（表1）。

2.2 不同发酵pH对不同菌种发酵的油茶粕单宁含量的影响

随着pH从3上升到8，不同菌种对油茶粕中单宁的分解能力呈现先升高后降低趋势，其中混菌发酵油茶粕单宁含量在pH为5时降低到最小值，且显著低于对照组和其他试验组（P＜0.05），此时单宁含量为0.51%（表2）。

2.3 不同发酵温度对不同菌种发酵的油茶粕单宁含量的影响

随着发酵温度从15℃上升到35℃，油茶粕中单宁的分解能力呈现先升高后降低趋势。混菌发酵油茶粕的单宁含量在28℃时降低到最小值0.48%，显著低于对照组和其他处理组（P＜0.05）（表3）。

表1 不同发酵时间下不同菌种发酵后的油茶粕中单宁的含量

3 小结与讨论

试验结果表明，不同发酵条件下，微生物发酵能够有效降解油茶粕中单宁，且对单宁的降解能力呈现先升高后降低趋势，其中黑曲霉和酵母菌的混菌试验组在发酵时间3d时，油茶粕中单宁含量降低至0.46%，显著高于其他试验组和对照组。

发酵时间为4d以上时，各处理组之间单宁含量没有显著差异。综合各菌种在不同时间段对油茶粕中单宁的降解结果，以混菌发酵效果最好，更符合实际生产要求。考虑到发酵时间延长会带来的生产成本的增加，以及油茶粕中单宁含量的升高，较适宜的发酵时间为3d。

温度和pH对发酵结果的主要影响是其对微生物的生长和相应酶活性的影响［10］。研究表明，真菌和植物产单宁酶pH稳定范围一般在4～6之间［11］。当混菌所分泌的单宁酶在pH为5时，有最强的活性。本研究中pH在5左右时，混菌对油茶粕中单宁的分解效果最显著，表明此时混菌分泌的单宁酶有最强的活性。

本研究中，发酵起始温度在28℃时，混菌对油茶粕中的单宁具有显著降解效果。这与苏二正等［12］、郭鲁宏等［13］的研究报道结果相符。28～32℃为黑曲霉最佳发酵培养温度范围，可能因为本研究中试验是在三角瓶中发酵，过程中产生了大量的热，而物料的热传导率低，导致短时间内热量难以消散；此外，在发酵过程中物料的收缩和空隙的减少也使热量难以消除，起始发酵温度稍低，经过发酵后发酵瓶内的温度升高，酶活性增强。

表2 不同pH条件下不同菌种发酵后的油茶粕中单宁的含量

表3 不同发酵起始温度条件下不同菌种发酵后的油茶粕中单宁的含量

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