硫酸类肝素二糖的质谱裂解规律探析

林江慧，张建伟，张惠芳，高建平，魏 峥

（福州大学糖生物化学研究所，福建福州 350002）

硫酸类肝素二糖的质谱裂解规律探析

林江慧，张建伟，张惠芳，高建平，魏 峥

（福州大学糖生物化学研究所，福建福州 350002）

硫酸类肝素结构决定了它与蛋白之间的相互作用，对硫酸类肝素结构的解析，能够进一步阐明结构与功能之间的关系。本实验采用电喷雾离子阱－多级质谱技术（ESI－MSn）在负离子模式（ESI－）下探析了12种硫酸类肝素二糖的裂解规律。实验发现：二糖中亚硫酸根的位置和数量对其在质谱分析中的稳定性起着决定作用，所含亚硫酸根越多越不稳定；N位亚硫酸根比C—2位和C—6位亚硫酸根更容易丢失。此外，二级质谱表明，同分异构体有其特定的裂解规律。该质谱裂解规律有助于硫酸类肝素二糖同分异构体的鉴定，可为多级质谱在硫酸类肝素结构研究中的应用提供理论依据。

硫酸类肝素二糖；结构；电喷雾离子阱－飞行时间质谱；裂解规律

硫酸类肝素（heparan sulfate，HS）是高度硫酸化线性糖胺聚糖，广泛存在于细胞表面和细胞基质中。HS在生物体生长发育、血管生成、凝血、细胞粘附，以及肿瘤转移中具有重要的生物学活性［1－5］，通过与酶、生长因子、细胞因子及细胞基质蛋白的相互作用调控众多的细胞信号通路［6－8］。这些重要的生物功能主要是由HS的特殊序列结构与蛋白质间的亲和作用以及HS完整链的性质决定的［9］。如C—6—O亚硫酸根是它与成纤维生长因子、血管生长因子相互作用的位点，能够调节肿瘤血管生长［10］。含C—2—O亚硫酸根的硫酸类肝素十糖能抑制FGF－2信号通路［11］。N－非取代葡萄糖胺是病毒黏附、侵入细胞必要的结构［12］。

HS是由重复二糖单元构成的聚糖链。二糖是由己糖醛酸（hexuronic acid，HexA）和葡萄糖胺（glucosamine，GlcN）以1～4糖苷键连接而成的。其中己糖醛酸可能存在4种结构，2种差向异构体－葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）或艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA），以及它们C—2—O位被硫酸化的衍生物。而葡萄糖胺的存在形式更为复杂，有N－乙酰葡萄糖胺（N－acetylglucosamin，GlcNAc）、N－硫酸化葡萄糖胺（N－sulfoglucosamin，GlcNS）和N－非取代葡萄糖胺（N－unsubstituted glucosamine，GlcNH），以及它们的C—6—O位和C—3—O位被硫酸化的衍生物。利用肝素酶酶解HS，能得到12种典型的硫酸类肝素二糖［12－16］，此类酶解产物的己糖醛酸中含有△4－，5－不饱和双键。由于HS的结构复杂性，使其结构组分研究极具挑战。

鉴于HS具有重要的生物功能，测定HS的精细结构是十分必要的。迄今为止，对HS结构测定主要集中在二糖组分的分析，主要采用的方法有毛细管电泳法［17］、聚丙烯酰胺凝胶电泳法［18］和液相色谱［19］法。以上方法都存在灵敏度不高，测定生物来源样品时杂质干扰较大等缺点。近十几年来，由于质谱的高灵敏度和高分辨率，使其在硫酸类肝素结构测定中的应用受到重视。目前，已报道了利用多种液相色谱－质谱联用体系分析硫酸类肝素二糖和寡糖的结构，如荧光标记－反相色谱－质谱体系［2021］、亚硝酸裂解－亲水色谱－质谱体系［22］、超压液相色谱－电喷离子化质谱体系［23－24］，另外也有采用串联质谱研究硫酸类肝素寡糖中亚硫酸根丢失的规律报道［25］。

本工作应用电喷雾离子阱－多级质谱法对12种硫酸类肝素二糖（肝素酶解产物）进行分析，主要探讨亚硫酸根对二糖结构稳定性的影响、同分异构体的区分以及二糖的裂解规律，以期为多级质谱在硫酸类肝素结构研究中的应用提供理论结构信息。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

离子阱飞行时间质谱仪：日本岛津公司产品；Mili－Q超纯水机：美国Millpore公司产品；离心浓缩仪：德国Christ公司产品；12种硫酸类肝素二糖（肝素酶酶解产物）△HexA－GlcNH（A），△HexA2S－GlcNAc（B），△HexA－GlcNAc（C），△HexA－GlcNAc6S（D），△HexA2S－GlcNH（E），△HexA2S－GlcNH6S（F），△HexA－GlcNH6S（G），△HexA2S－GlcNS（H），△HexA－GlcNS（I），△HexA－GlcNS6S（J），△HexA2S－GlcNAc6S（K），△HexA2S－GlcNS6S（L）：均为英国Idruon公司产品；乙腈：德国Memmert公司产品；乙酸铵：美国Sigma公司产品。

1．2 质谱条件

ESI源，负离子模式，雾化气流速1．50L／min，干燥气流速10L／min，加热模块温度200℃，曲形脱溶剂管（CDL）温度200℃，离子源电压4．5kV，检测器电压1．6kV，累积时间20ms，质量扫描范围m／z50～700，碰撞能量95％。

1．3 实验方法

准确吸取10μL 50mg／L肝素二糖溶液，在负离子模式下，手动注入质谱仪进行分析。

2 结果与讨论

2．1 二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc负离子模式质谱分析

二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的质谱分析及裂解方式示于图1。

△HexA－GlcNH准分子离子峰［M－H］－为m／z336．090 8，△HexA－GlcNAc的［M－H］－为m／z378．100 3。为了进一步分析二糖的裂解规律，选择m／z336．090 8进行二糖△HexA－GlcNH

二级裂解，碰撞能量为95％。而二糖△HexAGlcNAc选择m／z 378．100 3进行二级裂解。两种二糖都存在0，2X方式裂解，得到m／z 277．056 3，277．055 4碎片离子，以及0，2X方式裂解碎片失去一分子水后的到m／z259．045 7，259．045 9离子。两种二糖都存在2Y裂解碎片离子，分别为m／z 175．025 5，175．025 7。△HexA－GlcNAc存在特别的裂解方式［MH2O－H］－为m／z 360．087 9。这2个二糖都不含亚硫酸根，在质谱测试中，其结构相对较稳定，不存在钠加合现象。△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的质谱裂解规律差别不明显，主要原因是其结构非常相似。

图1 二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的1、2级质谱图及裂解规律Fig．1 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA－GlcNH and△HexA－GlcNAc

2．2 二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S负离子模式质谱分析

二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S的质谱分析及裂解方式示于图2。

二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S为同分异构体，准分子离子峰［M－H］－分别为m／z458．057 2和458．057 3。钠加合得到［M＋Na－H］－分别为m／z480．037 4和480．038 7。一级质谱中，△HexA2S－GlcNAc的2位亚硫酸根断裂得到m／z 378．991 9离子，△HexAGlcNAc6S失去水分子得到m／z 440．047 8离子，失去6－位亚硫酸根得到m／z 378．992 7离子。这2个二糖的一级质谱存在细微差别，在二级质谱裂解中有自身规律。它们都存在0，2X，0，5X裂解方式，△HexA2S－GlcNAc0，2X断裂失去一分子水得到碎片离子m／z259．998 2，△HexA－GlcNAc6S0，2X方式断裂得到碎片离子m／z357．012 1。△HexA2S－GlcNAc的2位亚硫酸根裂解，同时发生0，5X断裂失去一分子水得到碎片离子m／z300．037 3。△HexA－GlcNAc6S母离子6位亚硫酸根丢失，同时发生0，5X断裂失去一分子水得到m／z300．037 3。NAcX方式断裂失去一分子水得到m／z396．055 2。准分子离子峰失去一分子水［M－H2O－H］－得到m／z440．048 8和440．047 3。

图2 二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－GlcNAc6S的1、2级质谱图及裂解规律Fig．2 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNAc and△HexA－GlcNAc6S

不同之处是△HexA2S－GlcNAc存在3Y裂解得到m／z157．018 0，母离子2位亚硫酸根丢失后，失去一分子水得到m／z 360．090 2。而△HexA－GlcNAc6S存在0，2X1Y断裂产生m／z198．993 0，0，2Z裂解产生m／z342．048 2。

2．3 二糖△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的负离子模式质谱分析

△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的质谱分析及裂解方式示于图3。

△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS三个二糖互为同分异构体，准分子离子峰［M－H］－分别为m／z 416．045 7、416．046 0和416．046 2。在一级质谱中，由于只含1个亚硫酸根，产生的离子碎片较少，这3个二糖不存在钠加合现象。△HexA2S－GlcNH和△HexA－GlcNH6S存在少量的0，2X方式裂解碎片离子，而△HexA－GlcNS不存在。

△HexA2S－GlcNH选择m／z416．045 7进行二级裂解。母离子失去一分子水［M－H2OH］－得到m／z398．036 6。0，2X方式裂解得到m／z 357．011 9离子，0，2Z方式裂解得到m／z300．037 4。2位亚硫酸根断裂同时0，2X裂解后，失去一分子水得到m／z 258．029 1。1Y裂解得到m／z 236．969，1，3Y方式断裂得到m／z157．016 8。△HexA－Glc－NH6S选择m／z416．046 0进行二级裂解，失去一分子水得到［M－H2O－H］－m／z398．035 5。发生0，2X裂解得到m／z357．012 2，失去一分子水得到m／z338．998 3，0，2Z方式断裂得到m／z 300．038 1。6位亚硫酸根断裂同时0，2X断裂后，失去一分子水得到m／z 258．028 8碎片离子。0，2X1Y断裂产生m／z198．993 7碎片离子。二糖△HexA－GlcNS选取m／z 416．046 2进行二级裂解，失去一分子水得到［M－H2O－H］－m／z398．035 2，失去亚硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z336．091 5。0，2Z方式断裂得到m／z 300．039 5，1Y方式裂解失去一分子水得到m／z

137．990 2。△HexA2S－GlcNH和△HexA－Glc－NH6S的二级质谱主要区别在于，△HexA2SGlcNH存在3Y裂解方式，而△HexA－GlcNS存在特定的碎片离子m／z137．990 2。

图3 二糖△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的1、2级质谱图及裂解规律Fig．3 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S and△HexA－GlcNS

2．4 二糖△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的负离子模式质谱分析

△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的质谱分析及裂解方式示于图4。

△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S三个二糖互为同分异构体，准分子离子峰［M－H］－分别为m／z496．002 7、496．003 1和496．002 2。二糖分子中含有2个亚硫酸根，使分子结构在质谱测定中不稳定，一级质谱中产生的离子碎片较多，钠加合得到［M＋Na－H］－分别为m／z 517．983 4、517．984 5和517．984 4。△HexA 2S－GlcN 6S

失去1个亚硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z 416．046 1，同时0，2X裂解得到m／z357．011 2。已报道的N位亚硫酸根丢失，比2位、6位亚硫酸根裂解过渡态能垒低12．6～33．5kJ／mol［26］。因此，△HexA2S－GlcNS失去N位亚硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z416．047 0，接着0，2X裂解得到m／z357．011 2。同样，△HexA－GlcNS6S失去N位亚硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z 416．047 0，0，2X裂解得到m／z 357．019 4。△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S出现带2个电荷的准分子离子峰［M－2H］2－m／z 247．497 9和247．497 8。而△HexA2S－GlcN6S二糖没有出现，这可能与二糖游离氨基带正电有关。

图4 二糖△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的1，2级质谱图及裂解规律Fig．4 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS and△HexA－GlcNS6S

△HexA2S－GlcNS的二级裂解选取m／z 357．013 2，失去一分子水［M1－H2O－H］－得

到m／z 339．004 9碎片离子。2，4X裂解产生［M1－C2H4O2－H］－m／z 296．994 3，3Y方式裂解得到m／z 157．016 2。虽然△HexA2SGlcNH6S和△HexA2S－GlcNS的母离子不同，但都存在3Y裂解方式。△HexA2S－GlcNH6S存在0，2X1Y裂解方式，而△HexA2S－GlcNS有1Y裂解方式。△HexA－GlcNS6S有3Y裂解，同时失去一分子水。

2．5 二糖△HexA2S－GlcNS6S和△HexA2S－Glc－NAc6S负离子模式质谱分析

△HexA2S－GlcNS6S和△HexA2S－GlcNAc6S的质谱分析及裂解方式示于图5。

△HexA2S－GlcNS6S的一级质谱裂解方式较为复杂，准分子离子峰［M－H］－为m／z 575．962 4、钠加合得到［M＋Na－H］－为m／z 597．944 4，亚硫酸根丢失［M－SO3－－H］－为m／z496．004 6，亚硫酸根丢失钠加合离子碎片［M－SO3－＋Na－H］－为m／z517．986 6，0，2X裂解碎片为m／z 357．013 2。亚硫酸根丢失带2个电荷离子碎片［M－SO3－－2H］2－为m／z 247．498 6，钠加合现象明显。

二级裂解0，2X裂解碎片离子为m／z 440．047 3，0，2X裂解同时丢失2个亚硫酸根，失去一分子水得到m／z259．042 2，3Y裂解碎片离子为m／z 157．016 6，1Y裂解碎片离子为m／z236．970 9。丢失1个硫酸根，0，2Z裂解得到m／z300．037 4；失去2个硫酸根，同时失去一分子水得到m／z 396．058 3，2Y裂解碎片离子为m／z342．048 7。

二糖△HexA2S－GlcNAc6S的准分子离子峰［M－H］－为m／z 538．013 1，一级质谱碎片较多，出现钠加合峰m／z559．995 4。6位氧亚硫酸根裂解后得到m／z458．057 8，它的钠离子加合m／z480．930 8接着失去一分子水，得到m／z 440．047 5，2个电荷离子峰［M－2H］2－为m／z 268．502 8。

图5 二糖△HexA2S－GlcNS6S and△HexA2S－GlcNAc6S的1，2级质谱图及裂解规律Fig．5 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNS6S and△HexA2S－GlcNAc6S

二级裂解6－位氧亚硫酸根断裂，同时0，2X裂解失去一分子水得到m／z339．004 9，2，4X裂解得到碎片离子m／z 296．993 4，3Y裂解得到碎片离子m／z157．016 2。

通过计算12种硫酸类肝素二糖在负离子模式下理论m／z与测试m／z的偏差，可直观了解质谱测试的精确度，结果列于表1。经计算，偏差范围在－10．6×10－6～－3．0×10－6之间。

表1 硫酸类肝素二糖的质荷比及偏差Table 1 The m／z and error values of heparan sulfate disaccharide

一级质谱结果表明，含有2个和3个亚硫酸根的二糖都不稳定，易产生亚硫酸根的丢失。除△HexA2S－GlcNH6S外，其他二糖都带2个电荷碎片离子。△HexA2S－GlcNS6S二糖含有3个亚硫酸根，在质谱测试中最不稳定。在一级质谱中，N位亚硫酸根最容易裂解，其次是6位氧亚硫酸根，2位氧亚硫酸根。此外，葡萄糖胺残基出现环内断裂。含有1个亚硫酸根的二糖，不论是氧位硫酸化还是N位硫酸化，质谱中的分子结构都比较稳定。在带1个电荷状态下，亚硫酸根丢失较多，带2个电荷下，亚硫酸根丢失较少，亚硫酸根丢失是一个主要的裂解方式。二糖△HexA2SGlcN、△HexA－GlcNS6S和△HexA2S－GlcNS6S容易产生带2个电荷的准分子离子峰［M－2H］2－，△HexA－GlcNS则没有。N－乙酰化二糖△HexA2SGlcNAc、△HexA－GlcNAc、△HexA2S－GlcNAc6S和△HexA－GlcNAc6S中只有△HexA2S－GlcNAc6S存在带2个电荷的准分子离子峰，4个带游离氨基的二糖则没有，这说明高硫二糖容易出现带2个电荷的准分子离子峰，同时还与电荷分布有关。

3 结论

分子电荷状态和阳离子加合现象决定了硫酸类肝素质谱负离子模式中亚硫酸根丢失和糖骨架断裂。在质谱测试中，二糖中亚硫酸根的位点和数量影响结构的稳定，所含亚硫酸根越多越不稳定。N位亚硫酸根比O位亚硫酸根更容易裂解，二级质谱测定中二糖结构断裂有相似之处，但也有自身的特点。因此，在分析复杂的生物样品时，可以利用二级质谱更精确地定性和定量分析同分异构体，这可为生物样品糖组学的研究提供高精确度的分析手段。

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Study on the Fragmentation Patterns of Heparan Sulfate Disaccharides by ESI－MS

LIN Jiang－hui，ZHANG Jian－wei，ZHANG Hui－fang，GAO Jian－ping，WEI Zheng
（Institute of Glycobiochemistry，Fuzhou University，Fuzhou350002，China）

The structure of heparan sulfate determines its interaction with proteins，therefore the analysis of heparan sulfate can help further clarify structure and function relationships．The characteristic fragmentation pattern of twelve heparan sulfate disaccharide was discussed by electrospray ionization－ion trap mass spectrometry（ESI－MSn）in negative mode．The results show that the position and quantity of sulfate groups in disaccharide determine its stability in MS，moreover，C—2sulfate and C—6sulfate in disaccharide are more stable than N－sulfate．MS2revealed that the disaccharide isomers have a characteristic fragment pattern．The results may contribute to identify the disaccharides isomer of heparan sulfate，which can provide theoretical knowleage to identify the structural of heparan sulfate．

heparan sulfate disaccharides；structure；electrospray ionization－ion traptime flight mass spectrometry；fragmentation patterns

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0111－09

10．7538／zpxb．youxian．2014．0059

2014－03－10；

2014－06－02

国家自然科学基金（21343013）；国家基础科学人才培养基金项目（1103303）资助

林江慧（1981—），男（汉族），福建宁德人，糖生物化学专业。E－mail：linjianghui＠fzu．edu．cn

魏 峥（1969—），女（汉族），福建福州人，教授，从事糖生物化学、分析化学研究。E－mail：weizheng＠fzu．edu．cn

时间：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0059．html