复方甘草软膏的制备及含量测定法的建立

王 闰，孟 慧，许 勇

复方甘草软膏是我院的自制制剂，主要成分为甘草提取物及盐酸多塞平，用于荨麻疹、湿疹、过敏性皮炎、神经性皮炎及其引起的皮肤瘙痒，临床疗效较好。现代药理研究证实，甘草中皂甙类成分具有肾上腺皮质激素样作用和抗炎、抗变态反应等作用［1-3］;盐酸多塞平是传统的三环类抗抑郁药，近年来研究发现，多塞平尚有很强的抗H1与H2受体作用，其拮抗H1受体的作用较传统的抗组胺药苯海拉明强100倍［4］，临床上新用于治疗相关的皮肤病［5-7］。我院根据甘草提取物和盐酸多塞平药理作用，设计组方制备了复方甘草软膏，在临床取得了较好的疗效。为了保证医院制剂的质量，确保临床用药安全，本文建立了复方甘草软膏鉴别方法及含量测定方法。

1 试剂与仪器

甘草提取物(上海沪丰生物科技有限公司，药用，批号:20120306)，盐酸多塞平(上海沪丰生物科技有限公司，药用，批号:20120515)，甘草对照药材(新疆参茸中药饮片有限公司提供，批号:12032203)，盐酸多塞平对照品(上海西问实业有限公司，批号:20120408)，甘草酸标准品(中国食品药品检定研究院，批号:110731-201116)，甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，乙腈(色谱纯，美国 SIGMAALDRICH公司)，紫外分光光度仪(Lambda 14，美国Perkin Elmer公司)，Waters高效液相色谱仪(515型单元泵+2487型紫外检测器，美国Waters公司)。

2 实验方法

2.1 复方甘草软膏的制备 称取硬脂酸100 g、单硬脂酸甘油酯75 g、16醇20 g、18醇20 g、白凡士林50 g、羊毛脂20 g，混合加热融化，保持温度80℃;另取甘油50 g、三乙醇胺8 g、吐温-80 5 g、尼泊金甲酯1 g、尼泊金乙酯1 g加纯化水100 mL加热溶解，保持温度80℃，在搅拌下缓缓加入到上述油相中，继续搅拌乳化形成基质;将盐酸多塞平50 g溶解在80℃ 165 mL纯化水中，再加入甘草提取物250 g调成糊状后与上述基质混合，加入氮酮15 g和N-甲基吡咯烷酮15 g，搅拌均匀，待降温至40℃，将30 g薄荷脑溶于30 g液体石蜡中，再以等量递加法分次加入到以上混合物中，搅拌均匀至室温既得。

2.2 复方甘草软膏的鉴别 破乳:取适量的复方甘草软膏于100 mL烧杯中，加10%氯化钠溶液10 mL、甲醇40 mL，水浴加热熔化，加入冰浴中10 min，破乳提取后再经滤纸滤入100 mL的容量瓶中，取下滤纸放入烧杯中;再加入10%氯化钠溶液5 mL、甲醇20 mL，水浴加热熔化后，加入冰浴中10 min，再次破乳提取，合并滤入100 mL的容量瓶中。取下滤纸放入烧杯中，此次只加入20 mL甲醇溶液，同法滤入至100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.1 甘草的鉴别 取甘草对照药材1 g，加乙醚40 mL，加热回流1h，滤过，药渣加甲醇30 mL，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣分成两份，一份用甲醇溶解，一份用水溶解作为两组对照;与样品提取液一同点样于硅胶G薄层板上，以正丁醇-浓氨试液-水-乙醇(13∶1∶4∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色，于紫外灯下检视，并计算比移值(Rf值)。

2.2.2 盐酸多塞平的鉴别 取盐酸多塞对照品10 mg于100 mL量瓶中，加入10%氯化钠溶液15 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照。

取复方甘草软膏0.5 g于100 mL烧杯中，以1 mol/L HCL-甲醇溶液为溶剂，10%氯化钠溶液进行破乳提取，与甘草提取方法相同，提取盐酸多塞平，作为样品。另取未加盐酸多塞平，只加等量甘草提取物的同基质软膏，同法提取，作为样品的空白校正。于波长200～400 nm测定其紫外吸收，以及其在最高吸光度的吸收波长。

2.3 含量测定方法

2.3.1 甘草酸的测定 色谱条件:色谱柱:Waters C18 柱(3.9 ×150 mm)，粒度:5 μm，柱温:室温，流动相:乙腈-0.01 mol/L磷酸(30∶70)，流速:1.0 mL/min，检测波长:252 nm，进样量:20 μL。

标准品的制备:将甘草酸标准品20 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，稀释至刻度，冷藏备用。

样品的制备:取复方甘草软膏0.2 g于100 mL烧杯中，加入20 mL流动相，10%氯化钠5 mL，水浴加热融化后，加入冰浴中10 min，破乳提取后经有机滤膜滤入50 mL量瓶中，取滤膜放入烧杯加入15 mL流动相，10%氯化钠3 mL，水浴加热至融化后加入冰浴中10 min，破乳提取后经有机滤膜一并滤入50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀备用。

将标准液分别配置为浓度为 1.25、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的溶液，精密吸取20 μL 进样，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标(y)，以标准品浓度为横坐标(x)进行回归分析，计算回归方程。

2.3.2 盐酸多塞平的测定 色谱条件:色谱柱:Waters C18 柱(4.6 ×150 mm)，粒度:5 μm，柱温:室温，流动相:甲醇-乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠(35∶20∶45)，用2.0 mol/L 磷酸调 pH 至 2.5，流速:1.0 mL/min，检测波长:290 nm，进样量:20 μL。

对照品的制备:将盐酸多塞平对照品20 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，稀释至刻度，冷藏备用。

样品的制备:方法同2.3.1项下的样品制备。

将对照品溶液分别配置为浓度为1.25、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的溶液，精密吸取 20 μL 进样，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标(y)，以标准品浓度为横坐标(x)进行回归分析，计算回归方程。

精密吸取浓度为12.5 μg/mL的甘草酸标准品溶液和多塞平对照品溶液20 μL，分别在其色谱条件下，连续进样5次，计算其相对标准偏差(RSD)，考察测定方法的精密度;精密吸取浓度为12.5 μg/mL的甘草酸标准品溶液和多塞平对照品溶液20 μL，分别在其色谱条件下，于 0、2、4、8、12、24 h测定，测定甘草酸和多塞平的峰面积，计算其RSD，考察测定方法的稳定性;取复方甘草软膏(批号20140310)，按2.3项下方法制备样品溶液6份，分别在不同色谱条件下，求得甘草酸和多塞平的峰面积，计算其RSD，考察测定方法的重复性。

3 结果

3.1 乳膏的制备 所制备品为棕色软膏，气微香。

3.2 复方甘草软膏的鉴别

3.2.1 甘草薄层色谱(TLC)鉴别 复方甘草软膏中的甘草成分使用薄层色谱法进行鉴定。如图1所示，软膏样品的 Rf=1.5/7.5=0.2，对照药材(甲醇、水)的 Rf=1.5/7.5=0.2，根据薄层色谱的结果，表明制备的软膏中含有甘草成分。

图1 甘草鉴定的播出色谱图

3.2.2 多塞平的紫外鉴别 多塞平对照品和复方甘草软膏的紫外扫描分别见图2、图3，多塞平对照品和样品均在298 nm处有特征的紫外吸收，参考文献中多塞平在297 nm处有最大的紫外吸收［8］，根据紫外扫描图谱，表明制备的软膏中含有多塞平成分。在软膏样品进行紫外扫描时需排除甘草成分的干扰，因此同法制备只含甘草成分的软膏(不含多塞平)，进行破乳提取，作为样品测定时的空白对照。

图2 多塞平对照品紫外－可见扫描图谱

图3 软膏样品紫外－可见扫描图谱

3.3 含量测定方法

3.3.1 甘草酸和多塞平的测定 甘草酸标准品及软膏样品的高压液相(HPLC)图谱见图4、图5，以峰面积为纵坐标(y)，以标准品浓度为横坐标(x)进行回归分析，得回归方程:y=50 152x+12 391(r=0.9996)，线性范围为 1.25 ～50 μg/mL。

多塞平对照品及软膏样品的HPLC图谱见图6、图7，以峰面积为纵坐标(y)，以标准品浓度为横坐标(x)进行回归分析，得回归方程:y=32 367x+674 630(R=0.9995)，线性范围为1.25 ～50 μg/mL。

精密度实验，甘草酸和多塞平的RSD分别为0.78%和1.04%;稳定性实验，甘草酸和多塞平的RSD分别为0.75%和1.06%;重复性实验;甘草酸和多塞平的RSD分别为1.13%，1.45%。表明该测定方法符合要求。

图4 甘草酸标准品的HPLC图谱

图5 甘草酸样品的HPLC图谱

图6 多塞平对照品的HPLC图谱

图7 多塞平样品的HPLC图谱

3.3.2 样品测定 参考《中国药典》中相关的质量标准，规定本品1g软膏中甘草酸不得少于16.2 mg，多塞平的含量应为45～55 mg。取三组不同批号的软膏，测定甘草酸和多塞平的含量，结果见表1，均符合规定的质量标准。

表1 复方甘草软膏中甘草酸和多塞平的含量(mg/g软膏)

4 讨论

考虑到软膏中成分复杂，在测定甘草酸含量时，通过调整流动相极性延长了保留时间，从而排除干扰，达到准确测定的目的［9］。在测定多塞平时，选择了与测定甘草酸不同的流动相，文献报道多塞平存在异构体［10］，色谱可能出现双峰。依照相关文献［11-12］，采用 2.0 mol/L 磷酸调流动相的 pH 至2.5，取得了较好的结果。

关于复方甘草软膏中甘草酸和多塞平的含量的标准，参考了《中国药典》中复方甘草片及盐酸多塞平片的含量标准。复方甘草片的药典标准为每片含甘草浸膏粉112.5 mg，含甘草酸不得少于7.3 mg;而每克软膏中含有甘草提取物250 mg，根据复方甘草片中含甘草浸膏粉的量，折算得每克软膏中甘草酸不得少于16.2 mg，而测定的三批制剂，每克软膏中甘草酸都大于16.2 mg。盐酸多塞平片的药典标准为每片含多塞平应为标示量的90% ～110%，根据软膏制备时的投药量，每克软膏中多塞平的标示量为50 mg，即每克软膏中多塞平的含量应为45～55 mg，而测定的三批制剂，每克软膏中多塞平的含量均在标示量的90%～110%。本文所制定的含量标准可以更好地控制软膏的质量，保证临床的疗效。

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