超声波辅助乙醇法提取显齿蛇葡萄总黄酮的工艺研究

杨依函，蒋燕群，漆姣媚，张杰，付明，2*

（怀化学院1.生物与食品工程学院；2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化418008）

超声波辅助乙醇法提取显齿蛇葡萄总黄酮的工艺研究

杨依函1，蒋燕群1，漆姣媚1，张杰1，付明1，2*

（怀化学院1.生物与食品工程学院；2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化418008）

用超声波辅助乙醇浸提法提取显齿蛇葡萄叶中总黄酮，以二氢杨梅素为标准品，AlCl3为显色剂，紫外分光光度法测定总黄酮含量.在单因素试验的基础上进行L9（34）正交试验，以总黄酮含量为指标，分别考察乙醇浓度、料液比、浸提时间和超声波处理时间对显齿蛇葡萄总黄酮提取率的影响.结果表明该方法提取总黄酮的最佳条件是：乙醇浓度65%，料液比为1∶40，浸提时间30min，超声波处理时间20min.影响总黄酮提取因素的主次顺序为乙醇浓度、超声波处理时间、料液比和浸提时间，在最佳工艺下测得总黄酮含量为41.25%.

显齿蛇葡萄；超声波辅助乙醇法；黄酮；二氢杨梅素

显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）主要分布于粤、滇、贵、湘、鄂、赣、闽等海拔200～1 500 m的山地、灌木丛中，尤其适合在阴湿环境中生长.亦称藤茶、田婆茶等.其味甘甜，性凉，具有清热解毒、抗氧化、抗菌、抗炎、镇痛、抗肿瘤、降血压、降血脂、保肝护肝等功效.民间将其幼嫩茎叶制成保健茶，用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疱疖等症已有数百年的历史［1］，是一种典型的药食两用植物.显齿蛇葡萄中含有大量的黄酮类化合物，其中主要是二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）.研究表明，藤茶中总黄酮含量高达43.61%［2］，其中仅DMY的含量就高达39.5%［3］.

黄酮类化合物具有抗氧化［4］、清除自由基［5］，降血糖［6］、降血脂［7］，抗肿瘤［8］、抗抑郁［9］等作用，同时对各类肝损伤均有不同程度的保护作用［10，11］.显齿蛇葡萄中黄酮含量极高，具有开发潜力.但王家胜等测定不同产地显齿蛇葡萄中二氢杨梅素含量时没有筛选最佳提取工艺，曾云想等在用超声波提取总黄酮时没有考察超声波处理时间对黄酮提取率的影响，我们以DMY为标准品，在单因素实验的基础上进行正交实验以确定超声波辅助乙醇法提取显齿蛇葡萄总黄酮的最佳工艺，为进一步开发利用该植物提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料于2013年5月25日采自湖南省怀化洪江市，经怀化学院刘胜贵教授鉴定为显齿蛇葡萄.

DMY标准品（四川食品药品检验所，批号100080－200306）、AlCl3（天津市科密欧化学试剂有限公司）、石油醚（成都市科龙化工试剂厂）、无水乙醇、95%乙醇（天津市富宇精细化工有限公司），以上试剂均为分析纯.

1.2 仪器设备

JY99－IID智能型超声波细胞粉碎机、Beckman DU800紫外/可见光分光光度计、AL104型电子天平、FW177型中草药粉碎机、SW－420－2S型恒温水箱、CS101－IE电热鼓风干燥箱.

1.3 方法

1.3.1 材料处理

取经清水洗净并剪切的显齿蛇葡萄放入干燥箱中，于65℃下干燥后用粉碎机粉碎并过60目筛，密封干燥保存.

1.3.2 测定波长的确定［12］

称取显齿蛇葡萄粉末2.0 g置于索氏提取器中，用适量石油醚回流30 min，弃石油醚；温水浴中挥发残留石油醚.再加100 ml 95%的乙醇回流提取1 h，过滤后定容至100 ml.取适量样品液稀释至2.0 mg/ml.

取100μg/ml的DMY标准液、2.0 mg/ml的样品液和蒸馏水各0.2 ml，分别置于10 ml容量瓶中，然后向以上3只容量瓶中各加入3 ml 5%的AlCl3，摇匀静置10min.以加蒸馏水的溶液为空白，将DMY标准液和显齿蛇葡萄提取液于200～800 nm处扫描.二者在250～450 nm的吸光值如图1所示，它们在310 nm处都有最大吸光值，故选310 nm作为测定波长.

图1 DMY标准液、显齿蛇葡萄提取液扫描图

1.3.3 DMY标准曲线的绘制［13］

准确吸取50μg/ml的DMY标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml于6只10 ml容量瓶中，再加入3 ml 5%的AlCl3摇匀，并加95%乙醇定容至刻度，摇匀静置10 min.以DMY为0的溶液作为空白对照，测其余各管的A310；以A310对DMY含量作图，并进行线性回归.

1.3.4 显齿蛇葡萄黄酮含量的测定

称取显齿蛇葡萄粉末1.000 g于50 ml锥形瓶中加入一定体积一定浓度的乙醇溶液，于80℃恒温水浴中浸提一定时间，再用超声波处理一定时间后抽滤，把滤液定容至50 ml.取10μl提取液加入3 ml5%的AlCl3摇匀，再用95%乙醇定容至10 ml，静置10 min后测A310；根据回归方程及下列公式计算出黄酮含量：

式中，X：通过回归方程计算的DMY质量（μg）；n：稀释倍数；W：所取显齿蛇葡萄质量（g）.

1.3.5 单因素实验

称取显齿蛇葡萄粉末1.000 g于50 ml锥形瓶中进行黄酮类化合物的提取，分别考察乙醇浓度、料液比、超声波处理时间、乙醇浸提时间四个因素对黄酮提取率的影响.超声波处理后过滤，定容至50 ml，取一定体积的提取液测A310，然后按公式（1.1）计算黄酮含量.

1.3.6 正交实验

在单因素实验的基础上，以黄酮含量为考察指标，采用L9（34）正交表对上述四个因素进行正交实验，并对结果进行直观分析和方差分析.为了进一步证实最佳提取工艺，对正交实验得到的最佳提取条件进行验证性实验.

2 结果与分析

2.1 标准曲线与回归方程

DMY标准曲线如图2所示，当DMY浓度在0～12.5μg/ml范围时，相应吸光度在0～0.7464范围内，A310和DMY含量之间存在良好的线性关系，经过线性回归处理，可得回归方程为：A＝0.0060X－0.0044，R2＝0.9997.方法学考察实验的平均加标回收率为100.1%（RSD＝0.68%，n＝5）；DMY对照品和样品提取液显色后90 min内进行稳定性实验，RSD分别为0.44%和0.51%；精密度与重复性实验的RSD分别为0.65%和2.32%，说明该方法符合定量测定要求.

图2 DMY标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对黄酮含量的影响

分别称取样品1.000 g于5只100 ml锥形瓶中，分别加入30 ml 55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，置于80℃恒温水浴中浸提30 min，再用超声波处理15 min后抽滤定容至50ml.取6只10 ml容量瓶，其中一只加入10μl蒸馏水，其余5只分别加入10μl不同乙醇浓度下的显齿蛇葡萄提取液；再加入3 ml 5%的AlCl3摇匀，用95%乙醇定容至10 ml，静置10 min后测A310；根据回归方程及公式（1.1）计算出黄酮含量，结果如图3.

图3 乙醇浓度对黄酮含量的影响

由图3可以看出：样品中黄酮含量与乙醇浓度成正比，但是在乙醇浓度＞65%之后，直线的斜率明显变小，原因可能是随着乙醇浓度的增加，挥发程度增加，高浓度的乙醇对黄酮物质的溶出并无多大作用，考虑到经济效益，因此确定65%为最佳浓度.

2.2.2 料液比对黄酮含量的影响

分别称取样品1.000 g于5只100 ml锥形瓶中，向每只锥型瓶中分别加入10、20、30、40、50 ml 65%的乙醇溶液（即由2.2.1确定的最佳乙醇浓度），摇匀后置于80℃的恒温水箱中浸提30 min，再用超声波处理15 min，然后按2.2.1方法测定不同料液比下显齿蛇葡萄提取液中的黄酮含量，结果如图4.

图4 料液比对黄酮含量的影响

由图4可以看出：在料液比为1∶10～1∶30时，黄酮含量随乙醇用量的增加而显著升高，在料液比为1∶30时含量最高（41.02%）.再增加乙醇用量，含量反而有所下降，可能是因为一定比例的提取溶剂已经能够完全将显齿蛇葡萄溶出，再增加溶剂反而溶出更多的杂质而影响吸光值.因此料液比为1∶30时黄酮提取率最高.

2.2.3 超声波处理时间对黄酮含量的影响

图5 超声波处理时间对黄酮含量的影响

分别称取样品1.000 g于5只100 ml锥形瓶中，并向每只锥型瓶加入30 ml（即由2.2.2确定的最佳料液比）65%的乙醇溶液，摇匀后置于80℃的恒温水箱中浸提30 min，再用超声波分别处理0、15、30、45、60 min，然后按2.2.1方法测定不同超声波处理时间下显齿蛇葡萄提取液中的黄酮含量，结果如图5.

由图5可知：当超声波处理时间在0～15 min之间时，黄酮含量随超声波处理时间的增大而升高，然而当处理时间＞15 min后，黄酮得率反而下降，可能是因为超声波处理的时间过长使得部分黄酮被破坏，从而引起黄酮含量下降，故确定最佳超声波处理时间为15 min.

2.2.4 乙醇浸提时间对黄酮含量的影响

分别称取样品1.000 g于5只100 ml锥形瓶中，并向每只锥型瓶加入30ml65%的乙醇溶液，摇匀后置于80℃的恒温水箱中分别浸提10、20、30、40、50 min，再用超声波处理15 min（即由2.2.3确定的最佳超声时间），然后按2.2.1方法测定不同浸提时间下显齿蛇葡萄提取液的黄酮含量，结果如图6.

图6 浸提时间对黄酮含量的影响

由图6可知：在浸提时间10～20 min时，黄酮含量随着浸提时间的增加而显著升高.当浸提时间＞20 min时，斜率明显变小，并在浸提30 min时得率最高，而再延长时间时，含量反而有所下降，可能是部分黄酮被氧化，因此浸提时间以30 min为佳.

2.3 正交实验

为全面考察超声波辅助乙醇浸提法提取显齿蛇葡萄黄酮化合物的工艺参数，根据单因素试验结果及有关资料，对上述四因素进行正交试验设计，采用L9（34）正交试验测定显齿蛇葡萄中黄酮类化合物的含量.各因素水平见表1.分别准确称取1.000g样品于9只100ml锥形瓶中，按表2操作浸提显齿蛇葡萄黄酮.超声波处理完成后按2.2.1方法测定不同条件下提取液中的黄酮含量，结果见表2.

表1 因素水平表

表2 L9（34）正交实验结果

由表2可知RA＞RC＞RB＞RD，所以对超声波辅助乙醇法浸提显齿蛇葡萄黄酮类化合物工艺的影响程度为A（乙醇浓度）＞C（超声波处理时间）＞B（料液比）＞D（浸提时间），因素D（浸提时间）的极差最小，数据处理时作为最小误差项.因此确定超声波辅助乙醇法提取显齿蛇葡萄黄酮类化合物的最佳提取工艺条件为A2B3C3D2，即加入40倍于干物料65%的乙醇溶液，摇匀后置于80℃的恒温水浴中浸提30 min，再用超声波处理20 min.按照所确立的最佳提取工艺参数进行验证性实验，结果显齿蛇葡萄中黄酮类化合物平均含量＝（40.05%＋41.87%＋41.84%）/3＝41.25%.

3 讨论

提取黄酮化合物的方法主要有有机溶剂、热水、酶解、CO2超临界提取、大孔树脂吸附提取等［14］.热水提取法的提取率低，有机溶剂提取法存在排污量大的问题，CO2超临界提取法和酶法投资较大、成本高，大孔树脂吸附法使有机溶剂难以回收，损耗大、易燃易爆、对环境污染严重［15］.黄酮类化合物属细胞内产物，在提取时需要将植物细胞破碎，现有的机械破碎法难以将细胞有效破碎，化学破碎法易使黄酮类化合物的结构性质等发生变化，而超声波法简单快捷，提取率高，效果好［16］.

通常采用NaNO2－Al（NO3）3显色法，以芦丁作标准品测A510从而测得黄酮物质的含量，但具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在510 nm处也有较强吸收；而黄芩素、山柰酚等黄酮类成分在510 nm处没有吸收，因此该法不能排除非黄酮类物质的干扰，测定黄酮含量的专属性不强，而AlCl3比色法可以消除非黄酮类物质对显色的干扰［17］.因此，我们以DMY为标准品，采用AlCl3显色法测定显齿蛇葡萄黄酮类化合物含量；经波长扫描后确定其最大吸收波长为310 nm.

曾云想等比较了微波提取法、超声波提取法和乙醇回流法发现微波提取法是提取藤茶黄酮的最佳方法，在中档微波P50、料液比1∶35、微波处理90s时总黄酮得率达43.61%，但他们没有考察超声波处理时间对黄酮得率的影响，结果可能有出入；王家胜等采用超声波辅助提取、高效液相色谱法测定不同产区显齿蛇葡萄中DMY的含量，结果发现DMY的含量有很大差异，在2.50%～39.50%之间，但他们没有筛选最佳提取工艺.本研究采用超声波破碎细胞与乙醇浸提相结合的方法，在单因素实验的基础上通过正交实验得到最佳工艺为：乙醇浓度为65%，料液比为1∶40，超声波处理时间为20min，乙醇浸提时间为30min；在最佳提取工艺下，黄酮含量平均为41.25%.不同产地、不同生境下的显齿蛇葡萄总黄酮成分有区别，含量差异较大，在实际生产中应结合经济效益，进一步试验确定其最佳提取工艺.

显齿蛇葡萄是一种特色食药两用植物，其黄酮类化合物具有多种活性，有着广阔的开发前景.该提取工艺具有操作简单、生产成本较低、稳定性好、黄酮得率高等优点，为开发显齿蛇葡萄的黄酮类化合物提供了一定的参考依据.

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Technical Study on the Extraction of Flavonoids from Ampelopsis Grossedentata by the Ultrasonic－Assisted Ethanol Extraction

YANG Yi-han1，JIANG Yan-qun1，QIJiao-mei1，ZHANG Jie1，FUMing1，2*
（1.College of Biological and Food Engineering；2.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources，Huaihua University，Huaihua，Hunan 418008）

The total flavanoids from Ampelopsis grossedentata was extracted by the ultrasonic－assisted ethanol extraction.With dihydromyricetin as standard sample and AlCl3as developer，the amount of total flavonoids was determined by ultraviolet spectroscopy.On the basis of the single factor experiment，we employed L9（34）orthogonal test by using the content of total flavonoids as indicator and further examinewhether or not the ethanol concentration，the ratio of solid to liquid，extraction time and ultrasonic treatment time had an effect on the extraction efficiency of the total flavonoids from ampelopsisgrossedentata.The results indicated that the optimal conditionswere as follows：ethanol concentration 65%，the ratio of solid toliquid 1∶40，extraction time 20 mins.and ultrasonic time 30 mins.In conclusion，these results showed that the ethanol concentration，ultrasonic treatment time，the ratio of solid to liquid and extraction time were major factors affecting the extraction of total flavonoids.Under the optimum condition，the yield of total flavanoidswas41.25%.

ampelopsisgrossedentata；ethanolmethod with the aid of ultrasonic；flavanoids；dihydromyricetin

Q657.3

A

1671－9743（2015）11－0007－05

2015－09－20

湖南省高校创新平台项目（14K075）；2015年度湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（452）；湖南省植物学重点建设学科资助（201142）.

杨依函，1993年生，女，河南郸城人，2013级生物工程专业本科生.

*通讯作者：付明，1966年生，女，湖北荆门人，副教授，研究方向：药用植物的开发与利用研究.