UPLC-MS- MS法测定八 宝粥罐头中乙二胺四乙酸二钠残留量

杨长志，韩广源，姜 冰，魏冬旭，程 阳

（黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江 哈尔滨 15000 1）

UPLC-MS- MS法测定八 宝粥罐头中乙二胺四乙酸二钠残留量

杨长志，韩广源，姜 冰，魏冬旭，程 阳

（黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江 哈尔滨 15000 1）

建立超高效液相色谱-串联质谱法测定八宝粥罐头中乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium，EDTA-2Na）残留量的检测和确证方法。试样中残留的EDTA-2Na用水高速匀浆提取，提取液经三氯化铁衍生化、三氯甲烷和MAX阴离子交换柱净化后，用超高效液相色谱-串联质谱仪检测和确证，外标法定量。EDTA-2Na质量浓度在1.0～50.0 μg/mL范围内时，线性关系良好，EDTA-2Na的相关系数（R2）为0.992 2。在20～400 mg/kg添加范围内，样品平均加标回收率在79.4%～105.3%之间，相对标准偏差为7.93%～9.94%。EDTA-2Na的最低检出限为20 mg/kg。该方法具有灵敏、准确、稳定等优点，可用于八宝粥罐头中EDTA-2Na残留量测定。

乙二胺四乙酸二钠；超高效液相色谱-串联质谱；八宝粥罐头

乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium，EDTA-2Na）是GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》允许使用的一种食品添加剂[1]，可与铁、铜、钙、镁等多价离子螯合成稳定的水溶性络合物，利用其络合作用来防止由金属引起的变色、变质、变浊及VC的氧化损失，起到护色、抗氧化作用[2]。由于其良好的添加效果，常被作为抗氧化剂、防腐剂、稳定剂和凝固剂而广泛的应用于加工食品中[3]，但过多的EDTA-2Na被人食入后，会对人身造成伤害，其每日允许摄入量值为0～205 mg/kg。国外对EDTA在食品中的残留量有严格的限量规定。日本规定罐头食品中EDTA的残留（以乙二胺四乙酸二钠钙计）不得超过250 mg/kg，饮料中不得超过35 mg/kg[4]。我国在八宝粥等罐头食品中规定不得超过250 mg/kg[1]。

目前，有关于食品中EDTA-2Na残留量国内报道很多[5-8]，但针对八宝粥等罐头食品中EDTA-2Na残留检测无文献报道，大多采用液相色谱法进行检测，样品经水提取，经CuCl2或三氯化铁衍生后，采用离子对试剂和C18柱进行液相色谱分析检测，检出限达50～100 mg/kg。国外有关食品中EDTA-2Na的含量检测的文献报道不多，Hamano等[9]采用分光光度法测定食品中EDTA-2Na的含量，利用三氯化铁衍生后进行分析检测，线性范围在0.5～40.0 ☒g/mL；Brilliantes等[10]采用液相色谱法测定罐装海产品中EDTA-2Na的含量，用弱乙酸提取，经CuCl2衍生后，采用C8柱进行液相色谱分析检测，线性范围为25.1～301.7 mg/kg；Cagnasso等[11]采用液相色谱法测定非酒精饮料中EDTA-2Na的含量，定量限为2.0 mg/L；Fingerhut等[12]在新生儿筛查中采用液相色谱-串联质谱法测定干血浆样品中EDTA-2Na的含量，样品经四丁醇酯化后，采用液相色谱-串联质谱法进行测定，方法的定量限为84 μmol/L；Xie等[13]采用反相离子对液相色谱法测定生活废水中EDTA-2Na的含量，定量限为0.005 mg/L；Quintana等[14]采用反相离子对液相色谱-串联质谱法测定水中EDTA-2Na的含量，定量限为0.001 mg/kg。本研究的关键是采用三氯化铁衍生化、三氯甲烷和MAX阴离子交换柱净化，用超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法检测和确证，外标法定量，取得了满意的结果。该方法具有快速、灵敏、准确等特点，能满足国内外检测限量要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、三氯甲烷、三正丁胺（均为色谱纯） 美国Fisher公司；甲酸（纯度88%，分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；冰乙酸（分析纯） 天津市光复科技发展有限公司；盐酸（优级纯） 天津市耀华化学试剂有限责任公司；三氯化铁（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；EDTA-2Na标准品（CAS：6381-92-6，纯度≥99%） 美国Sigma-Aldrich公司；实验用水均为去离子水；MAX阴离子交换柱（150 mg，6 mL）美国Waters公司；水相滤膜（0.22 ☒m） 天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

Quattro Premier UPLC-MS-MS仪（配电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）源） 美国Waters公司；电子天平（感量0.01 mg、0.01 g） 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；组织捣碎机 上海精科实业有限公司；离心机 湘仪离心机仪器有限公司；旋涡混合器、均质器 德国IKA公司；超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；氮吹仪 美国Organomation公司；螺旋盖聚丙烯离心管（50 mL）；玻璃具塞离心管（25、50 mL)；MAX阴离子交换柱，使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

三氯化铁溶液0.02 mol/L：称取0.540 6 g三氯化铁，溶于90 mL水中，转移到100 mL容量瓶中，加入0.03 mL盐酸，用水定容至刻度，混匀；10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）：移取100 mL甲醇，溶于880 mL水中，加入1.17 mL三正丁胺，用冰乙酸调节pH 3.5，转移到1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀；95%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺pH 3.5）：移取950 mL甲醇，溶于30 mL水中，加入1.17 mL三正丁胺，用冰乙酸调节pH 3.5，转移到1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀；10%甲酸-甲醇溶液：移取10 mL甲酸，溶于40 mL水中，转移到100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。

标准储备溶液：分别准确称取适量的EDTA-2Na标准品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，分别得质量浓度为10 mg/mL的标准储备溶液，此溶液转移至储液瓶中4 ℃贮存1 个月。

标准中间溶液：准确吸取EDTA-2Na储备溶液10 mL于50 mL棕色容量瓶中，用水稀释成质量浓度为2 mg/mL的标准中间溶液，此溶液转移至储液瓶中4 ℃贮存1 个月。

标准工作溶液：根据需要使用前用空白样品基质配制适当混合标准工作溶液。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Phenyl柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相梯度洗脱程序见表1；流速0.25 mL/min；柱温25 ℃；进样量5 ☒L。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution program of mobile phaseTable1 Gradient elution program of mobile phase

1.3.3 质谱条件

离子源：ESI负模式；扫描方式：多反应监测；离子源温度：110 ℃；去溶剂气（氮气）流量：550 L/h；去溶剂温度：350 ℃；锥孔气（氮气）流量：50 L/h；碰撞气（氩气，纯度≥99.999%）压力：3.30×10－4kPa；毛细管电压：3.0 kV；其他质谱参数见表2。

表2 EDTA-2Na衍生物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞气能量Table2 RM transtions of precursor/prouuct ion foor qualitative and quantitative analysis, cone voltage, collision energy of EDTA-2Na derivative

1.3.4 样品前处理

1.3.4.1 提取

称取八宝粥罐头试样约5 g（精确到0.01 g）于50 mL螺旋盖聚丙烯离心管中，加入15 mL水，再加入20 mL三氯甲烷，用均质器以10 000 r/min均质2 min，4 500 r/min离心5 min。将上清液转移至50 mL玻璃具塞离心管中。再用15 mL水重复提取两次，合并提取液于同一个50 mL玻璃具塞离心管中，待衍生化和净化。

1.3.4.2 衍生化[2]

样品溶液的衍生化：向上述提取溶液中加入1.0 mL 0.02 mol/L三氯化铁溶液，混合，于超声波中超声20 min，冷却至室温后，转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

标准溶液的衍生化：准确吸取适当质量浓度的标准工作液于50 mL玻璃具塞离心管中，加入40 mL水和1.0 mL 0.02 mol/L三氯化铁溶液，以下操作同样品溶液衍生化。

1.3.4.3 净化

准确移取5 mL上述衍生化样品溶液转移到MAX阴离子交换柱中，控制流速在1～2 mL/min，弃去流出液。用5 mL水、5 mL甲醇和3 mL 10%甲酸-甲醇溶液淋洗，弃去流出液。最后用6 mL 10%甲酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液经80 ℃氮吹仪吹干后，用5 mL水溶解并定容，过0.22 ☒m滤膜，供UPLC-MS-MS测定。

2 结果与分析

2.1 测定方法的选择

乙二胺四乙酸常用H4Y表示，由于其在水及酸中的溶解度很小，常用的为其二钠盐：Na2H2Y2H2O ，也简写为EDTA。当溶液的酸度很高时，两个羧基可再接受H＋，形成H6Y2+，相当于一个六元酸，有六级离解常数：Ka1=10—0.9、Ka2=10—1.6、Ka3=10—2.1、Ka4=10—2.8、Ka5=10—6.2、Ka6=10—10.3；7 种形式：H6Y2+、H5Y+、H4Y、H3Y—、H2Y2—、HY3—、Y4—；当pH＜1时，主要以 H6Y2+形式存在；当pH＞11 时，主要以Y4—形式存在配位离子[15]。可以看出，EDTA是极性很强化合物，如果不进行金属离子络合和采用离子对试剂，很难采用液相色谱法（紫外检测器）测定其含量，国内外的文献报道大都基于此；Quintana等[14]采用反相离子对液相色谱-串联质谱法测定水中EDTA-2Na的含量，主要利用EDTA-2Na与三氯化铁络合反应，使测定EDTA-2Na成为可能。所以本方法最后选用UPLC-MS-MS进行研究，探讨一种针对食品中EDTA-2Na含量检测的确证方法，经实验本方法的检出限为20 mg/kg，完全能满足食品中EDTA-2Na检出限为25 mg/kg的要求。

2.2 衍生化试剂的确定

由于EDTA是极性很强化合物，极容易与金属离子络合，形成稳定的螯合物。EDTA为六齿螯合剂，可以一个分子和二价及三价金属以1∶1比例形成螯合物。在溶液中存在多种金属离子时，EDTA螯合优先与稳定常数大的金属离子进行反应。螯合物稳定常数表示EDTA金属螯合物的稳定状态，lgK（稳定常数）越大，表示该螯合物越稳定，越有利优先发生螯合反应。EDTA螯合金属离子稳定性排序为Mo6+＞Bi3+＞ Fe3+＞Cu2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+＞K+＞Ca2+＞Mg2+。虽然Mo6+和Bi3+稳定常数大，但在食品中含量是极微量的，所以用Fe3+与EDTA-2Na螯合进行含量测定要比有些文献方法采用CuCl2作为衍生化试剂要稳定得多，其螯合物见图1。所以本方法中选择FeCl3作为衍生化试剂进行方法检测是可靠、可行的。

图1 EDTA-2Na螯合物Fig.1 Chelate of EDTA-2Na

2.3 净化方法的选择和优化

八宝粥罐头等样品基质，虽然进行了三氯甲烷初步的净化，但仍然达不理想的净化效果，色谱峰分叉比较明显，无法进行UPLC-MS-MS测定，见图2。为此，选择固相萃取柱的净化实验。分别选择HLB、C18、WAX、NH2、MAX柱进行了固相萃取柱的净化实验，结果表明：HLB、C18、WAX、NH2柱的保留效果不好，起不到净化的目的；MAX柱保留效果和净化效果都比较理想，但洗脱起来非常困难。如果酸度不够，很难将EDTA-2Na的衍生物从MAX柱洗脱下来。为此，进行了洗脱溶剂的选择。首先，选取0.2 mol/L三氯乙酸和甲醇，配制成5%三氯乙酸-甲醇溶液、10%三氯乙酸-甲醇溶液、20%三氯乙酸-甲醇溶液、30%三氯乙酸-甲醇溶液进行MAX柱的洗脱实验，结果表明：20%三氯乙酸-甲醇溶液只用10 mL就能完全将EDTA-2Na的衍生物洗脱下来。但如果不吹干直接上液相色谱-质谱测定是不行的，因为三氯乙酸的酸度太大，质谱的峰形很差，无法进行定量分析。即使进行吹干处理，处理后样品中仍然有酸性存在，所以不采用这种洗脱方式。其次，选取甲酸、水和甲醇，主要考虑甲酸是挥发性有机酸，容易吹干，配制成2%甲酸-甲醇-水溶液（2∶50∶48，V/V）、5%甲酸-水-甲醇溶液（5∶50∶45，V/V）、10%甲酸-水-甲醇溶液（10∶50∶40，V/V）、15%甲酸-水-甲醇溶液（15∶50∶35，V/V）进行了MAX柱的洗脱实验，结果表明：2%甲酸-甲醇-水溶液和5%甲酸-水-甲醇溶液所用的洗脱体积大约在15 mL以上，15%甲酸-水-甲醇溶液洗脱又太快，仅需要1 mL，而10%甲酸-水-甲醇溶液所用洗脱体积在6 mL以内，吹干后进行质谱检测，峰形很好，所以本净化方法选择了10%甲酸-水-甲醇溶液作为洗脱溶剂，具体的洗脱曲线见图3。

图2 未经MAX柱阴离子交换柱净化的EDTA-2Na色谱图Fig.2 MRM chromatogram of EDTA-2Na without MAX anion exchange column purification

图3 MAX柱阴离子交换固相萃取柱洗脱曲线Fig.3 Elution curve from MAX anion exchange solid-phase extraction column

2.4 色谱柱和流动相的选择

据文献[4,6-7]报道，利用液相色谱分析EDTA螯合物常用的色谱柱为C18色谱柱，流动相通常采用四丁基氢氧化铵溶液等离子对试剂进行分析。如果对EDTA螯合物采用UPLC-MS-MS进行分析测定，其色谱柱要有一定保留，且离子对试剂要具有很强的挥发性，通常的离子对试剂是不能使用。为此，本实验选择了C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Phenyl（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）液相色谱柱和含有一定量三正丁胺的甲醇溶液作为流动相进行实验。结果表明：C18液相色谱柱的色谱峰不尖，而且分叉；而Phenyl液相色谱柱没有出现这种情况，而且分离度和灵敏度都能满足要求，所以本实验的定量分析选择Phenyl液相色谱柱作为本实验方法的色谱柱。对于流动相的选择，选择4 种不同溶剂配比：10%甲醇溶液（含5 mmol/L 三正丁胺，pH 3.5）-100%甲醇、10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）-80%甲醇溶液、10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）-90%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）、10%甲醇溶液（含5 mmol三正丁胺，pH 3.5）-95%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）。结果表明：10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）-90%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）和10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）-95%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）这两种流动相，EDTA螯合物的出峰时间和峰形都比较理想，但10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）-95%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）的灵敏度要优于10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）-90%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）。所以本实验方法的流动相选择为10%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）-95%甲醇溶液（含5 mmol/L三正丁胺，pH 3.5）。

2.5 线性范围的确定

在方法所确定的实验条件下，取一系列不同质量浓度的EDTA-2Na标准溶液，进行衍生化，然后以仪器响应峰面积对EDTA-2Na质量浓度进行线性回归，结果表明：当EDTA-2Na质量浓度在1.0～50.0 μg/mL范围内时，线性关系良好，其相关系数（R2）为0.992 2，回归方程为y=1 368.57x＋470.384。当样品中的EDTA-2Na质量浓度超过上述两个线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。

2.6 方法的检出限、回收率和精密度

2.6.1 检出限

根据有关国家在八宝粥罐头等食品中对EDTA-2Na限量要求，而采用添加法进行实测的情况确定。EDTA-2Na的检出限为20 mg/kg，其基质的标准品谱图、检出限谱图和基质的空白谱图参见（图4～6），可满足国外限量要求。

图4 EDTA-2Na标准品多反应监测色谱图（20 mg/kgg）Fig.4 MRM chromatogram of EDTA-2Na standard derivative (20 mg/kg)

图5 八宝粥罐头样品添加（20 mg/kg）色谱图Fig.5 Chromatogram of spiked standard reference (20 mg/kg) in canned eight-ingredient porridge

图6 八宝粥罐头样品空白色谱图Fig.6 Chromatogram of blank sample of canned eight ingredient porridge

2.6.2 方法的回收率实验和精密度实验

本方法以八宝粥罐头为研究对象，采用添加法进行了3 个水平的回收率实验，其回收率、精密度的结果见表3。由表3可以看出，EDTA-2Na添加20、100、400 mg/kg时，样品平均加标回收率在79.4%～105.3%之间，相对标准偏差为7.93%～9.94%，符合残留分析的要求。

表3 八宝粥罐头中EDTA-2Na的回收率、精密度（n==66）Tablee 3 Recoveries and relative standaar deviations of EDTA-2Na in canned eight-ingredient porridgee (n = 6)

2.7 实际食品样品的测定

选取实际八宝粥罐头样品，平行测定2 次，取平均值，所测实际样品中EDTA-2Na的含量结果见表4。

表4 实际食品样品测定结果（n=2）=2 Table 4 Results obtained by the method for EDTA-2Na inreal food samples (s (n n = 2) 2)

3 结 论

本实验采用固相萃取技术和UPLC-MS-MS技术相结合的分析方法，解决了八宝粥罐头等样品基质干扰严重的难题，为食品中EDTA-2Na检测和确证，探索了一套新颖的样品前处理方法和色谱分析方法。该方法应用于实际样品检测，效果理想。

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Determination of Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Residues in Canned Eight-Ingredient Porridge by UPLC-MS-MS

YANG Changzhi, HAN Guangyuan, JIANG Bing, WEI Dongxu, CHENG Yang
(Heilongjiang Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectr ometry (UPLC-MS-MS) method was developed for the determination and confirmation of ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA-2Na) residues in canned eight-ingredient porridge. The EDTA-2Na residues in the test samples were extracted with water by means of high-speed homogenization. The extract was derivatized with FeCl3reagent, cleaned up by chloroform and MAX anion exchange column. The residues were determined and confirmed by UPLC-MS-MS using an external standard method. The linear range was 1.0–50.0 ☒g/mL for EDTA-2Na with a correlation coefficient (R2) of 0.992 2. The average recoveries of EDTA-2Na in spiked samples ranged from 79.4%–105.3%, with relative standard deviations between 7.93% and 9.94% at spiked levels of 20–400 mg/kg. The limit of detection was 20 mg/kg for EDTA-2Na. The method is sensitive, accurate, repeatable and suitable for the determination of EDTA-2Na residues in canned eight-ingredient porridge.

ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA-2Na); ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); canned eight-ingredient porridge

O657.6

A

1002-6630（2015）04-0208-05

10.7506/spkx1002-6630-201504041

2014-03-18

国家认证认可管理委员会资助项目（2009B548）

杨长志（1962—），男，研究员，硕士，主要从事食品安全和检测研究。E-mail：yangcz621126@163.com