姜黄素增加U937细胞对TRAIL的敏感性的凋亡机制研究

焦卫云，陈道俊，柯章敏，鲍杨漪

(1.安徽医科大学第三附属医院，安徽合肥 230001;2.安徽医科大学公共卫生学院，安徽合肥 230032)

白血病是血液系统恶性肿瘤，化疗药物的耐药及较大的毒副反应使白血病的治疗效果欠佳，导致肿瘤易复发且患者远期生存率不高［1］。姜黄素是从中药姜黄中提取的一种有效化学成分，大量研究证实其具有抗炎，抗氧化，抗肿瘤等多种生物学功能。有研究发现姜黄素对多种肿瘤细胞具有增殖抑制，促进凋亡，抑制血管生成等效应，然而其具体机制尚不清楚［2］。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，与肿瘤细胞表面相应配体 DR4，DR5，DcR1，DcR2结合，发挥生物学功能且对正常的细胞无明显抑制作用，是治疗肿瘤一种具有良好前景的药物［3-4］。本课题研究姜黄素联合TRAIL对白血病U937细胞的凋亡的影响，同时观察DR5的表达变化，旨为白血病的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人白血病细胞株U937购自中国科学院上海细胞生物库。姜黄素(美国 Sigma公司，纯度 ＞99%);IMEM培养基、胎牛血清购于Gibco公司，MTT和二甲基亚砜(DMSO)购自碧云天公司，凋亡检测试剂盒为贝博公司产品，DR5抗体购自BD公司，重组人TRAIL购自eBiosicence公司，流式细胞仪为BD公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 U937细胞株培养 在含10%胎牛血清、双抗(100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素)的IMEM培养基中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 对细胞增殖抑制的检测 采用常规MTT法，取对数生长期的U937，以2×104/孔细胞接种96孔板，加入终浓度为 5、10、20、40 μmol·L-1的姜黄素及 1、10、100、1 000 μg·L-1的TRAIL，同时设无细胞的空白对照孔，每组设3个复孔，继续孵育24 h，继续检测前加入20μL的MTT，继续在培养箱中孵育4 h，弃去上清，每孔加入150μL DMSO，室温振荡10 min，经酶标仪在490 nm波长检测相应的吸光度(A)，抑制率 =(对照组 A值 -实验孔 A值)/对照组 A值 ×100%。每组实验重复3次，取平均值。

1.2.3 流式细胞仪检测 收集处于对数生长期的U937细胞以109·L-1接种于6孔板，10μg·L-1的TRALL联合加入姜黄素(5、10、20、40 μmol·L-1)，设不加药组为对照组，每组设3个复孔，24 h后，收集各实验组和对照组细胞，用PBS洗涤3次，调整细胞数至1010·L-1，加入3只离心管，每管100μL细胞悬液，分别加入5μL PI及10μL Annexin V的荧光抗体，避光孵育15 min，经流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 蛋白免疫印迹杂交 收集处于对数生长期的U937细胞，配成1011·L-1细胞悬液，接种于6孔板，10μg·L-1的TRALL联合加入姜黄素(终浓度分别为10、20、40μmol·L-1)，设不加药组为对照组，继续培养24 h，收集U937细胞，用 PBS 洗涤 3 次，1 800 r·min-1离心 10 min，弃上清，细胞沉淀内加入强效细胞裂解液300μL和蛋白酶抑制剂3 μL，冰上裂解30 min，取上清置于EP管内，4℃ 12 000 g离心15 min，收集上清作为总蛋白，考马斯亮蓝定量试剂盒进行蛋白检测，BCA法检测蛋白浓度，双蒸水配平，每管加入蛋白处理液30μL，混匀煮沸5 min，按每泳道蛋白样品40 μg加入SDS-PAGE样品孔内，电泳后半干电转移至硝酸纤维膜上，一抗(鼠抗人DR5)、二抗孵育及显色、扫描条带，Imagel软件分析灰度值。

1.3 统计分析 采用SPSS13.0统计软件处理数据。实验观测资料，主要为计量资料，以±s表示，均行正态性检验。多组间均数比较采用单因素方差分析，多重比较方法为LSD检验。两独立组间的比较为成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素、TRAIL对U937的作用结果 实验结果显示5～40μmol·L-1的姜黄素对U937有明显的细胞增殖抑制作用，加药组的增殖抑制作用显著高于对照组(5μmol·L-1)，差异有统计学意义(P＜0.05)。不同浓度的 TRAIL作用24 h后，其对U937无明显增殖抑制作用，与对照组(1 μg·L-1)比较，除最高的剂量组(B4)外，差异多无统计学意义(P＞0.05)。结果见表1。

表1 姜黄素及TRAIL对U937细胞的增殖抑制率(±s)

注:单因素方差分析。

A:姜黄素/μmol·L-1 24 h观测值(n=9)B:TRAIL/μg·L-1 24 h观测值(n=9)空白组 A0:0.0 0.5 ±0.1 B0:0.0 0.5 ±0.1对照组 A1:5.0 5.9 ±1.2 B1:1.0 4.6 ±1.8剂量组 A2:10.0 18.7 ±3.6 B2:10.0 5.6 ±2.4 A3:20.0 29.4 ±5.1 B3:100.0 6.9 ±2.9 A4:40.0 42.8 ±6.9 B4:1000.0 8.7 ±3.5整体分析:F，P 99.191，0.000 3.859，0.018多重比较 A2 vs A1 5.778，0.000 B2 vs B1 0.762，0.452:LSD-t，P A3 vs A1 10.558，0.000 B3 vs B1 1.803，0.081 A3 vs A2 4.780，0.000 B3 vs B2 1.041，0.306 A4 vs A1 16.574，0.000 B4 vs B1 3.208，0.003 A4 vs A2 10.796，0.000 B4 vs B2 2.446，0.020 A4 vs A3 6.016，0.000 B4 vs B3 1.405，0.170

2.2 流式细胞仪检测U937细胞的凋亡率 U937细胞经1、10、100、1 000 μg·L-1的 TRAIL 作用24 h 无凋亡发生，5、10、20、40 μmol·L-1的姜黄素作用 24 h 的凋亡率分别为(4.7 ± 0.7)%、(9.8 ± 1.2)%、(15.6 ± 3.1)%、(24.8 ±4.5)%，10 μg·L-1的 TRAIL 联合 5、10、20、40 μmol·L-1的姜黄素作用24 h的凋亡率分别为(15.6±1.5)%、(26.7±3.5)% 、(49.7 ±6.5)% 、(76.7 ±10.5)%，与相应单独姜黄组比较有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 姜黄素单独或联合TRAIL对U937细胞的凋亡率(±s)

表2 姜黄素单独或联合TRAIL对U937细胞的凋亡率(±s)

注:姜黄素浓度如表中所示，TRIL浓度为10.0μg·L-1。比较方法为成组t检验。

n 对照组 5 μmol·L-1 10 μmol·L-1 20 μmol·L-1 40 μmol·L -1姜黄素94.3 ±0.5 4.7 ±0.7 9.8 ±1.2 15.6 ±3.1 24.8 ±4.5姜黄素 +TRAIL 9 4.7 ±0.6 15.6 ±1.5 26.7 ±3.5 49.7 ±6.5 76.7 ±10.5两组相比 t，P 1.536，0.144 19.755，0.000 13.703，0.000 14.206，0.000 13.630，0.000

2.3 WB法检测DR5表达率 10μg·L-1的TRALL联合10、20、40 μmol·L-1的姜黄素作用 24 h 后的 U937 细胞，其DR5蛋白表达明显上调，与空白对照组比较有明显不同。参见图1。

3 讨论

白血病是造血干细胞因分化阻滞，凋亡障碍和恶性增殖而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤，目前白血病的治疗仍以化疗为主，然而肿瘤的耐药及较强的毒副作用使80%左右的患者复发［5］。

近年来，中医药在治疗白血病方面取得了一定的疗效。姜黄素使从姜科植物中药姜黄的地下根茎中分离出来的具有广泛生物活性的物质［6］。在实验和临床研究中发现其具有抗氧化，抗感染和抗肿瘤的生物学活性。研究证实姜黄素在体外可以协同5-氟尿嘧啶，全反式维甲酸，顺铂，塞来昔布，柔红霉素等对结肠癌，胃癌，肝癌，宫颈癌，前列腺癌等多种细胞株具有协同杀伤效应［7-8］。大量研究证实姜黄素通过抑制NF-κB活性，抑制转录增殖相关基因(cyclin D1)，抗凋亡相关基因(XIAP，survivin)等抑制耐药的多发性骨髓瘤细胞增殖，从而逆转肿瘤的多药耐药(MDR)，为姜黄素单独或联合其它化疗药物逆转MDR，减轻化疗的不良反应提供了强有力的依据［9］。另有研究进一步证实姜黄素逆转的MDR，可能是通过抑制肿瘤抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，恢复Smac蛋白的释放，从而打开内源性凋亡途径，经线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。本研究发现，姜黄素对白血病U937细胞具有明显的增殖抑制及促凋亡作用，提示姜黄素单药可能对多种肿瘤细胞具有溶瘤效应，为姜黄素在临床中的使用提供了实验依据。

TRAIL属于肿瘤坏死因子家族，其与肿瘤细胞表面相应配体DR4，DR5，DcR1，DcR2结合启动细胞信号传导通路，在体外实验中证实可以诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡，且对正常的细胞无明显抑制作用，是治疗肿瘤一种具有良好前景的药物。TRAIL与激活型受体DR4，DR5结合后，募集Fas相关死亡域蛋白(FADD)，procaspase-8形成死亡复合物，形成死亡诱导信号复合物(DISC)，最终激活下游caspase-3，诱导肿瘤细胞凋亡。诱骗受体DcR1和DcR2缺乏完整的胞内段，竞争性与TRAIL结合，抑制细胞凋亡［10］。研究发现在小细胞肺癌患者中，10.6%的患者DR5死亡结构域的基因发生突变，在头颈部肿瘤中也验证了同样的改变，表明死亡受体的突变可能参与肿瘤的发生和进展。另有研究证实在某些对TRAIL抵抗的肿瘤细胞中，其表面激活型受体表达下调，诱骗型受体上调或细胞内抗凋亡蛋白(Bcl-2，c-FLIP等)的高表达，致其对TRAIL不敏感。我们的实验也发现单独TRAIL对U937细胞无任何毒性。因此，如何增敏TRAIL对肿瘤的杀伤研究尤为迫切。实验中发现，低剂量TRAIL联合不同浓度的姜黄素可显著提高对肿瘤的杀伤，经流式细胞仪及免疫蛋白印迹法检测后，发现经不同浓度的姜黄素作用24 h后的U937细胞，其表面及细胞内的DR5蛋白明显上调，表明姜黄素增敏TRAIL对U937的杀伤可能是通过上调DR5而实现的。

综上所述，TRAIL对恶性肿瘤的治疗具有广阔的前景，然而肿瘤细胞是否对其敏感将直接影响其疗效，因此如何联合其它药物增敏肿瘤对其杀伤成为免疫细胞治疗成功的关键。本研究证实中药提取物姜黄素通过上调DR5可增加白血病U937细胞对TRAIL的敏感性，为临床治疗复发性白血病提供了新的思路，然而其协同作用机制仍需进一步研究。

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