缺氧缺血性脑病新生儿外周血淋巴细胞钟基因表达的变化*

李永富冯 星

缺氧缺血性脑病新生儿外周血淋巴细胞钟基因表达的变化*

李永富①冯 星②

目的：通过比较足月缺氧缺血性脑病患儿与正常足月新生儿外周静脉血中淋巴细胞（Peripheral blood lymphocytes cell，PBLC）中钟基因Clock mRNA、Bmal1 mRNA含量水平的变化，研究探讨HIE所致的昼夜节律紊乱中对钟基因的影响。方法：采用半定量逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）测定32例缺氧缺血性脑病患儿（HIE组）与24例正常足月新生儿（对照组）外周血淋巴细胞中Clock mRNA、Bmal1 mRNA的含量，并比较各组之间的差异。结果：HIE组外周血淋巴细胞中Clock mRNA和Bmal1 mRNA 的水平均低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），HIE组外周血淋巴细胞中Clock mRNA、Bmal1 mRNA含量的变化趋势基本一致。结论：HIE患儿PBLC中Clock mRNA、Bmal1 mRNA表达存在异常，两者可能在缺氧缺血后昼夜节律紊乱的发生起着一定的作用。

脑缺氧； 脑缺血； 新生儿； 外周血淋巴细胞； 钟基因

缺氧缺血性脑病（Hypoxic–ischemic encephalopathy，HIE）是指儿科临床上常见的一种严重疾病，在新生儿中的患病率约为3‰～6‰，其中15％～20％在新生儿期死亡，其余约1/4～1/3会存在不同类型和程度的远期后遗症，成为危害我国儿童生活质量的重要疾病之一[1]。HIE的发病机制复杂，不仅存在电解质、血糖等内环境改变，相关递质受体的变化、细胞凋亡等，在缺氧后，患儿的血压节律也发生紊乱，说明生物节律的变化也参与其中，成为了当前儿科临床研究的重点之一[2-4]。笔者希望通过研究HIE患儿外周静脉血淋巴细胞中Clock mRNA和Bmal1 mRNA的含量水平变化来探讨HIE中钟基因的变化及影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 （1）选取2012年6月-2013年11月在苏州儿童医院新生儿科和苏州市立医院本部新生儿科住院治疗的HIE患儿32例为HIE组，均符合《实用新生儿学》（第4版）中的诊断标准。（2）选取24例同时期在苏州儿童医院新生儿科和苏州市立医院本部新生儿科住院治疗的患儿为窒息组，出生时1 min Apgar评分＜3分，5 min Apgar评分＜5分，但临床表现及影像学检查等均不符合缺氧缺血性脑病[5]。上述患儿胎龄在37+1～41+4周，出生体重为2650～3900 g。（3）选取2012年8月-2013年11月在苏州市市立医院本部产科正常分娩的健康足月新生儿32例为对照组，胎龄在37～41+5周，出生体重为2550～3950 g。上述患儿均在出生24 h内采取外周静脉血3 mL，为尽量避免时间因素影响，采血时间为上午9～12时。三组患儿在胎龄、出生体重比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 三组患儿的胎龄、出生体重比较（±s）

表1 三组患儿的胎龄、出生体重比较（±s）

组别胎龄（周）出生体重（g）HIE组（n=32）39.26±1.533514.35±406.27窒息组（n=24）41.02±1.653376.89±471.98对照组（n=32）39.54±1.543199.55±503.42 F值0.22550.0880 P值0.79860.9158

1.2 仪器与试剂 美国Perkin Elmer仪器有限公司96孔温度梯度PCR扩增仪（GeneAmp PCR system 9600）；美国BIO-RAD公司电泳系统（170-3930 Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell）；日本三洋-60 ℃低温冰箱；Ficoll淋巴细胞分离液，上海华精生物高科技有限公司；TRIzol Reagent：Invitrogen Life Technologies。

1.3 PCR引物 PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Clock和Bmal1 mRNA及内对照β-actin的上、下游引物如下：

内对照β-actin引物：（产物大小227 bp）：上游引物P1 5'-GTA AAG ACC TCT ATG CCA ACA-3'；下游引物P2 5'-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT-3'。

Clock引物：（产物大小433 bp）：上游引物P5 5'-CAG GGC ACC ACC CAT AAT–3'；下游引物P6 5'-CCG AGA AGA GGC AGA AGG-3'。

Bmal1引物：（产物大小309 bp）：上游引物P3 5'-GTA GGT TAG TGG TGC GAC AT-3'；下游引物P4 5'-GCT TGG GAG GAG TTA GGG-3'。

1.4 RNA提取及RT-PCR过程 抗凝全血分离出淋巴细胞后，采用TRIzol Reagent提取总RNA，逆转录生成CDNA后进行PCR，扩增产物置于4 ℃冰箱保存备用。以上标本的PCR扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳；电泳结束后将凝胶在0.5％溴化乙锭（EB）显色剂中染色30 min，放在紫外光检测仪进行观察，采用Image pro-plus 6.0图像分析系统对结果数码拍照进行图像分析，然后用Image-pro plus测定扩增产物条带的灰度值，以β-actin作为内参照对比，半定量分析Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量，对数值进行统计学处理。

1.5 统计学处理 使用SAS 9.3医学统计软件进行分析处理，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用t检验，组内比较用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患儿PBLC中Clock mRNA表达水平比较 HIE组患儿中Clock mRNA含量为（0.6511±0.1973），对照组为（0.7814±0.1426），窒息组为（0.7283±0.1094）。HIE组患儿中Clock mRNA含量与对照组比较差异有统计学意义（t=-3.028，P＜0.05）；窒息组患儿中Clock mRNA含量与对照组比较有降低，但差异无统计学意义（t=-1.518，P＞0.05）；HIE组患儿中Clock mRNA含量较窒息组低，差异有统计学意义（t=-1.726，P＜0.05）。三组患儿Clock mRNA的相关表达见图1～3。

图1 三组患儿PBLC中Clock mRNA表达水平柱形图

图2 HIE组与窒息组Clock mRNA PCR电泳图

图3 对照组Clock mRNA PCR电泳图

2.2 三组患儿PBLC中Bmal1 mRNA表达水平比较 HIE组Bmal1 mRNA含量为（0.5664±0.2875），窒息组为（0.6267±0.2183），对照组为（0.7261±0.2451）。HIE组Bmal1 mRNA含量明显降低，与对照组比较差异具有统计学意义（t=-2.391，P＜0.05）；窒息组中Bmal1 mRNA表达水平比对照组略有降低，但差异无统计学意义（t=-1.573，P＞0.05）；HIE组Bmal1 mRNA含量较窒息组低，但差异无统计学意义（t=0.858，P＞0.05）。三组患儿PBLC中Bmal1 mRNA相关表达见图4～6。

3 讨论

本试验通过对HIE患儿PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA表达水平进行研究，发现其在缺氧缺血后发生了变化，进一步证明了缺氧缺血能对人体生物节律造成影响。笔者知道，在人类生物节律中枢（SCN）和多种外周组织中均有多种生物钟基因的的表达[6]。而且，进一步的研究证明，人类胎儿的SCN对光已有反应，而且外周生物钟组织已开始形成，而且在出生前胎儿期就已经初步形成昼夜节律；另外，也发现了时间因素可以影响新生儿的外周血单个核细胞中Bmal1基因的表达[7-9]。而且，缺氧缺血作为一个独立的因素，可以影响动物松果体中的钟基因表达，因此，外周生物钟组织之一的外周血淋巴细胞中的钟基因也应该发生相应的变化，在笔者的实验中也证实了这一点。

图4 三组患儿PBLC中Clock mRNA表达水平柱形图

图5 HIE组与窒息组Bmal1 mRNA PCR电泳图

图6 对照组Bmal1 mRNA PCR电泳图

3.1 缺氧缺血性脑病对PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量水平的影响 本实验发现，发生缺氧缺血性脑病后，HIE组PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量比对照组降低明显，差异有统计学意义（P＜0.05），笔者分析认为，其原因可能与缺氧缺血后血浆中的褪黑素浓度水平发生了变化有关系。动物研究表明，褪黑素作为组织细胞间的化学信使，对各种生物钟基因起到调节作用，其释放入血的昼夜变化规律和Clock mRNA的表达水平变化几乎一致，同样，Clock和Bmal1基因的表达也受到褪黑素浓度的影响[10-11]。研究同样证明了婴儿松果体分泌的褪黑素参与调控人体的昼夜节律[12]。在缺氧缺血性脑病患儿，严重的缺氧缺血损伤了SCN神经细胞和松果体，导致代谢紊乱，从而抑制褪黑素的合成以及向外周血的分泌，这种变化和年龄有关[13-14]。外周血中褪黑素水平的下降，抑制了PBLC中钟基因的转录，Clock mRNA和Bmal1 mRNA的含量也随之降低。

通过动物模型的实验，笔者已经发现，发生HIBD新生大鼠松果体中的CLOCK、BMAL1合成发生了明显的改变，同样证实了缺氧缺血能够影响Clock mRNA和Bmal1 mRNA的表达[15]。

另外，在缺氧缺血性脑病患儿PBLC中，Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量水平相比窒息组患儿下降更为明显。笔者推测，PBLC中，生物钟基因表达不仅仅受缺氧缺血因素的影响，发生HIE后，神经细胞损伤更为严重，出现了细胞凋亡和内环境较大改变，进一步影响了生物钟Clock和Bmal1基因的表达。

3.2 Clock和Bmal1与缺氧缺血的关系 笔者的研究表明，PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA的含量水平在缺氧缺血后均发生了明显变化，Clock mRNA和Bmal1 mRNA在HIE后表达降低。分析原因：（1）已经证明，核心的生物钟基因Clock和Bmal1的昼夜节律变化与机体的血糖水平是呈正相关的，缺血缺氧后组织细胞中的葡萄糖迅速消耗，血糖水平降低，Clock mRNA表达随之减少[16]。（2）组织细胞发生缺氧后，NAD+依赖性酶SIRT1被激活，从而影响Clock、Bmal1的转录[17]。（3）缺血缺氧后SCN和松果体中褪黑素的合成和分泌受到影响。（4）钟基因Clock、Bmal1作为核心基因，其蛋白产物CLOCK和BMAL1形成螺旋-环-螺旋（helix–loop–helix）的异二聚体CLOCK/BMAL1，其变化存在相同趋势[18]。

综上所述，缺氧缺血性脑病是多因素多机制共同作用下导致的严重疾病，昼夜节律的紊乱亦参与其中，既是疾病导致的结果，也可能影响疾病的转归，而且昼夜节律的改变也可以反映机体的生理和病理状态。对生物钟系统的研究能够为深入研究HIE的发病机制提供新的思路，进一步阐述HIE的病理生理变化。同时笔者也希望在临床上进行调整恢复生物钟系统，能够更好地辅助治疗缺氧缺血性脑病。

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The Changes of Biological Clock Genes’ Expression in PBLC of HIE Neonates/

LI Yong-fu，FENG Xing.// Medical Innovation of China，2015，12（10）：011-014

Objective：To study the effect of circadian rhythm disorder induced by HIE in clock genes through the comparison changes of hypoxic ischemic encephalopathy full-term neonates and normal neonates in the peripheral blood lymphocytes cell （PBLC） in biological clock gene Clock mRNA， Bmal1 mRNA levels.Method：32 patients of HIE and 24 normal full-term newborns were determinated by semi quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR） in PBLC Clock mRNA， Bmal1 mRNA，the difference between groups were compared.Result：In groups HIE the levels of Clock mRNA and Bmal1 mRNA displayed significantly lower than the control groups， the difference was statistically significant（P＜0.05），the changes trend of Bmal1 mRNA and Clock mRNA in peripheral blood lymphocytes of HIE groups were basically in the same.Conclusion：The expression of Clock mRNA and Bmal1 mRNA were abnormalin PBLC of HIE group， which may plays a certain role in hypoxia and ischemia occurred after the disorder of circadian rhythm.

Brain hypoxia； Brain ischemia； Neonates； Peripheral blood lymphocytes cell； Clock gene

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.10.004

2015-01-12） （本文编辑：周亚杰）

江苏省卫生厅面上科研课题（H200519）

①江苏省苏州市立医院本部 江苏 苏州 215002

②苏州大学附属儿童医院

冯星

First-author’s address：Suzhou Municipal Hospital，Suzhou 215002，China