肛周尖锐湿疣高频电刀电灼后应用祛疣汤外洗降低复发率的研究

刘远成　张劲远　王健　彭西兰　叶伟明

(安徽医科大学第三附属医院　安徽)



肛周尖锐湿疣高频电刀电灼后应用祛疣汤外洗降低复发率的研究

刘远成张劲远王健彭西兰叶伟明

(安徽医科大学第三附属医院安徽)

[摘要]目的观察肛周尖锐湿疣高频电刀电灼后应用祛疣汤外洗后的复发率，及其对皮损区CDla朗格尔汉斯细胞和P53基因表达的影响。方法将59例肛周尖锐湿疣患者随机分为治疗组(30例)，术后应用祛疣汤外洗,对照组(29例)，术后应用高锰酸钾液外洗。3个月后采用免疫组化等病理分析技术观察肛周尖锐湿疣的复发率及皮损区CDlaLC数量和P53调控基因的变化。结果治疗组复发3例(10.00%),对照组复发8例(27.59%),差异有统计学意义(P<0.05)。术后3个月皮损区CDlaLC细胞的数量，治疗组增加明显，优于对照组; 治疗组皮损区术后3个月组织中P53基因表达降低明显，高于对照组(P<0.05)。结论肛周尖锐湿疣高频电刀电灼后应用祛疣汤外洗可显著降低复发率；通过增加皮损区CDlaLC细胞数量及降低P53基因的表达来降低其治疗后的复发率。

[关键词]肛周尖锐湿疣；祛疣汤；朗格罕氏细胞；P53基因

尖锐湿疣[1](Condyloma Acuminata,CA)是由人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)感染所致的皮肤黏膜良性增生性疾病,是最常见的性传播疾病之一。不仅好发于外生殖器，更亦累及肛周，形成肛周尖锐湿疣(perianal condylomaacuminata,PCA),在临床上易复发甚至恶变，其原因除了患者全身免疫功能下降外，更多学者认为，局部免疫功能的异常是致病的重要因素。郎格尔汉斯细胞[2](Langerhans cells，LC)是启动免疫应答的关键细胞，在抗HPV感染中作用非常重要。CDla分子是LC的标记分子，与LC的抗原提呈功能有关，野生型基因P53[3]是细胞内重要的肿瘤抑制基因和凋亡调节基因， 也是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性极高的基因， 其参与细胞周期的调控、 诱导细胞凋亡和激活DNA修复，本研究采用免疫组化方法对肛周尖锐湿疣电灼术后应用祛疣汤熏洗对皮损区CDlaLC的数量、形态及皮损区P53调控基因影响的观察，探讨祛疣汤降低肛周尖锐湿疣复发率的可能机制，其报告如下。

1材料与方法

1.1病例资料59例尖锐湿疣标本来源于安徽医科大学附属第三医院我科就诊患者，符合《性病诊疗与预防》的CA诊断标准[4]，皮损均取自肛门周围原发部位及附近，诊断明确。所有患者均经电灼手术治疗后，其中治疗组30例，男19例，女11例，年龄28.4±1.6岁。对照组29例，男19例，女11例，年龄31.2±2.0岁，各组患者在病程、疣体、性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2标本的制备和免疫组化染色

1.2.1标本的制备治疗组术后应用祛疣汤熏洗，对照组术后应用高锰酸钾液清洗。设定3个月为1个疗程，观察祛疣汤熏洗治疗肛周尖锐湿疣的临床疗效及安全性，通过皮损区活检取材固定后并通过免疫组化的方法，分别观察术后3个月的疗效及复发率。

药物使用方法，治疗组:单用祛疣汤熏洗液1000 mL，每天两次，每次20 min。对照组:采用应用高锰酸钾液1/1000浓度1000 mL浸泡，每天2次，记录复发情况及不良反应，并定期取材标本行免疫组化检查。

1.2.2免疫组化染色所有标本均经 10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 um厚度连续切片，CDla鼠抗人单克隆抗体, 兔抗人单克隆抗体工作液、浓缩型DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化操作均严格按照说明书步骤进行。用已知阳性标本做阳性对照， PBS代替一抗做阴性对照。

1.3结果判定将染色后的切片置于光学显微镜下观察 ，光镜下观察，细胞膜或细胞浆呈黄褐色树枝状突起的细胞为CDla阳性LC。每张切片任意取LC分布最密集的5个区域，在高倍视野下计数CD1a阳性细胞数目。以5个高倍视野下CDla 阳性细胞平均值记为LC数目。P53蛋白阳性染色定位于细胞核。细胞阳性表达强度按照以下方法进行半定量分析：①按细胞着色强度：浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②按阳性细胞百分比：≤5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分， 51%～75%为3分,≥76%为4分，两者分值的乘积即为细胞阳性表达强度，其分级方法为：O分为阴性(-),1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++),9～12分为强阳性(+++)。采用单盲法,每张切片任选两个皮片,每个皮片随机选取表皮层5个高倍(400 倍)视野进行评分，取其得分的平均数作为该标本分值。将(+)～(+++)归为阳性表达组计算阳性率。

1.4统计学处理采用SPSS13.0统计分析软件，率的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1治疗组复发3例，占10.00%,对照组复发8例，占27.59%,经统计学处理差异有统计学意义(P<0.01)，观察两组治疗药物对皮肤和破损皮肤的刺激性患者均能耐受。

2.2治疗组患者3个月后CDlaLc与对照组比较，数量明显增多，差异有统计数字意义(P<0.05)。

表1　治疗组和对照组CDlaLC数(±s，%)

表1　治疗组和对照组CDlaLC数(±s，%)

组别治疗前治疗后治疗组12.0±1.526.0±1.4*#对照组11.4±1.416.7±2.3*

注：治疗前与治疗后比较*P<0.05；治疗组与对照组比较#P<0.05

2.3治疗组和对照组3个月后CDla朗格汉斯细胞免疫组化图见图1a，图1b。

2.4P53基因蛋白在治疗组与对照组的表达情况见表2。

2.4P53基因蛋白在治疗者和对照组术后3个月表达的免疫组化图见图2a，图2b。

图1a　治疗组CDla朗格汉斯细胞(×400)

图1b对照组CDla朗格汉斯细胞(×400)

表2　治疗者和对照组术后3个月皮损区基因蛋白表达(±s,n)

表2　治疗者和对照组术后3个月皮损区基因蛋白表达(±s,n)

组别-++++++阳性率治疗组(n=30)2711110.0%*对照组(n=29)2053131.0%

注：治疗组与对照组比较*P<0.05

图2a　治疗组基因蛋白表达(×400)

图2b对照组基因蛋白表达(×400)

3讨论

LC是骨髓衍生来的树突状细胞[5]，主要存在表皮内，是免疫系统的重要成员，主要通过识别 、捕获 、处理及提呈抗原 ，辅助 T细胞分化增殖 ，从而启动特异性免疫应答[6]，发挥局部免疫监视作用。在病毒感染性皮肤病中 ，LC起着传递病毒抗原的重要作用，CA皮损局部 LC数量减少 ，形态改变，难以将表皮内的病毒抗原递呈给真皮内的免疫活性细胞，不能形成针对 HPV[7]的特异性细胞及体液免疫反应，造成皮损持续存在或治疗后容易复发。

祛疣汤为我院院内制剂，药物组成：鸦胆子15 g(压碎后下)、土茯苓30、苦参30、薏苡仁15 g、枯矾15 g。现代药理证实鸦胆子仁或油对正常皮肤或黏膜面有刺激作用,系一种细胞毒,临床上治疣或乳头状瘤有效，土茯苓是历代医家治疗阴疮之要药，药理实验也证实该药有抑制病毒作用。该方经我科临床使用，疗效确切，且使用安全。本实验证实肛周CA电灼后通过祛疣汤外洗，其复发率明显降低，与对照组差异有统计学意义。

我们选择检测祛疣汤治疗CA前后局部皮损处LC膜表面CDla抗原分子的表达和术后3个月的表达变化来阐述其祛疣的可能作用机制。本实验通过祛疣汤外洗后发现皮损区CDlaLC的数量较对照组增加明显(P>0.05)，且经祛疣汤治疗后病理切片可见取材区LC胞体变大，树突状突起明显延长或增多，分布较均匀，表皮全层均可见细胞浆和细胞膜呈明显的黄褐色；而对照组中皮损区CDla朗格汉斯细胞数量较治疗前也有明显改善，但其CDlaLC数量明显少于治疗组，且部分树突结构不完整，两者比较，差异有统计学意义。说明祛疣汤外洗可能通过增强患者局部LC的免疫功能，从而有效地防止其复发。

此外在正常细胞中野生型P53半衰期短，不易检出，而在尖锐湿疣组织[8]中，P53基因与HPV病毒结合,导致其半衰期延长和稳定性增强， 可用免疫组织化学的方法检测出来， 此时的P53蛋白是突变和失活的[9]， 它不仅失去了正常野生型 P53蛋白的生长抑制作用，还具有癌基因的功能，可直接转化细胞、促进肿瘤的发生或赘生物的形成。本实验中治疗组的P53蛋白的表达率较对照组显著降低，差异有统计学意义(P>0.05),提示祛疣汤可能通过降低CA组织中突变的P53基因蛋白的表达，从而降低其组织的增生，提高了治疗的敏感性，降低肛周CA复发的可能。

参考文献

[1] Leszczyszyn J, Lebski I, Lysenko L,et al. Anal Warts (Condylomata Acuminata)-Current Issues and Treatment Modalities[J].Adv Clin Exp Med，2014，23(2):307-311.

[2] Mayumi N1, Watanabe E, Norose Y,et al. E-cadherin interactions are required for Langerhans cell differentiation.[J].Eur J Immunol，2013，43(1):270-280.

[3] Xian L1, Zhao J, Wang J ,et al. Promotes proteasome-dependent degradation of oncogenic protein HBx by transcription of MDM2.[J].Mol Biol Rep，2010，37(6):2935-2940.

[4] 叶顾章，邵长庚.性病诊疗与预防[M].北京：人民卫生出版社，2002：662-663.

[5] Rich FJ1, Kuhn S, Hyde EJ,et al. Induction of T cell responses and recruitment of an inflammatory dendritic cell subset following tumor immunotherapy with Mycobacterium smegmatis[J].Cancer Immunol Immunother，2012，61(12):2333-2342.

[6] Remes Lenicov F, Varese A, Merlotti A,et al. Prostaglandins in semen compromise the immune response against sexually transmitted pathogens[J].Med Hypotheses，2014，pii: S0306-9877(14)00190-X. doi: 10.1016/j.mehy.2014.04.028.

[7] Drobniak SM1, Wiejaczka D, Arct A,et al.Sex-specific heritability of cell-mediated immune response in the blue tit nestlings (Cyanistes caeruleus)[J].J Evol Biol，2010，23(6):1286-1292.

[8] Manzione TD, Nadal SR, Calore EE,et al.Local control of human papillomavirus infection after anal condylomata acuminata eradication[J].Rev Col Bras Cir，2014，41(2):87-91.

[9] 李晶，徐洪玉，皮庆友，等.Maspin和P53蛋白在尖锐湿疣组织中的表达及意义[J].新医学， 2012，43(9):648-650.

Study on the recurrence rates of perianal condyloma acuminata washed by Quyou soup after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator

Liu Yuancheng,Zhang Jinyuan,Wang Jian,et al.(Department of Coloproctology,the Third Afflliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei,230061,China)

[Abstract]Objective To observe the recurrence rates of perianal condyloma acuminata washed by Quyou soup after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator, and the effects on the numbers of CDla langerhans cells and the expressions of P53 gene in skin lesion area. Methods 59 subjects of perianal condyloma acuminata were randomly assigned to the treatment group (N=30) and the control group (N=29). The perianal areas of the treatment group and the control group were respectively washed by Quyou soup and potassium permanganate solution after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator. The recurrence rates of perianal condyloma acuminata, the effects of the numbers of CDla langerhans cells and the regulation of P53 gene in skin lesion area were observed by immunohistochemical inspection. Results There are 3 cases of recurrence (10.00%) in the treatment group and 8 cases of recurrence (27.59%) in the control group, which has a significant difference by statistics analysis. Compared with the control group, the numbers of langerhans cells were significantly increased, and the expressions of P53 genein were significantly decreased in the treatment group(P<0.05). Conclusion The Quyou soup may inhibit the recurrence rates of perianal condyloma acuminata after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator, and increased the numbers of CDla langerhans cells and decreased the expression of P53 gene in skin lesion area.

[Key words]Perianal condyloma acuminata；Quyou soup；Langerhans cells；P53 gene

[收稿日期：2015-03-10]

[中图分类号]R657.1

[文献标志码]A

[文章编号]1009-8771(2015)03-0186-04