酶标分析仪波长标准物质的研制

杨欣欣，张彬，荀其宁，拓锐，胡国星，潘忠泉

（中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031）

酶联免疫吸附试验（ELISA，简称“酶免试验”）是现代医学临床检验的基本检测技术，免疫临床标志物(抗原／抗体)具有无法替代的临床意义，操作简便，技术可靠，因而酶免试验成为传染病血清学标志物、肿瘤标志物及内分泌等各种临床免疫指标检测的主导技术［1–3］。

酶标分析仪是一种基于酶免试验的专用医学仪器，因具有特异性强、重复性好、敏感性高、快速安全等优点，广泛用于医院、血站、防疫站、生物制品生产企业等部门。JJG 861–2007［4］规定分别采用标称波长为405.0，450.0，492.0，620.0 nm的介质膜干涉滤光片作为检定酶标分析仪波长示值误差及重复性的标准物质。

当白光入射到干涉滤光片内部时，在多层介子膜上会产生多次反射。滤光片的光学玻璃基片及其表面所镀的介子膜具有锐截止特性，使得透射光线变成了单色光［5–6］。目前国外暂无酶标分析仪相关标准物质的报道。国内在用的标准物质为吉林省计量科学研究院研制的酶标分析仪检定用滤光片标准物质（干涉滤光片），波长范围为400.0～700.0 nm，波长不确定度为0.7 nm（k=2）。

笔者研制的酶标分析仪检定用波长标准物质（以下简称波长标准物质）标称峰值波长分别为405.0，450.0，492.0，620.0 nm，峰值波长不确定度为0.7 nm(k=2），该波长标准物质量值稳定、均匀性好，便于携带，有效期为1年，可满足多通道酶标分析仪波长示值误差及重复性检定的需要。

1 主要仪器设备

外圆排锯切割机：YTH1–A–JB型，北京中西远大科技有限公司；

研磨机：HD2M9B–5L型，宜兴晶科光学仪器有限公司；

抛光机：JY2M16B–5L型，益阳精益机器制造有限公司；

真空镀膜机：DM–450型，北京仪器厂；

紫外可见近红外分光光度计：Lambda900型，美国PE公司。

2 设计原理

光学玻璃具有稳定的物理化学特性，受外界因素影响非常小。波长标定用窄带滤光片的基本结构是法布里–柏格滤光片，作为波长标准物质，要求滤光片满足稳定的中心波长、窄的带宽、高透过率、高的环境稳定性、高的温度稳定性等性能要求，这些要求不是瞬时的而是永久的。

根据光学薄膜理论，选择两种不同折射率的材料组成多层光学薄膜元件来制备波长标准物质。其中，光学薄膜的峰值波长、峰值透射比、半宽度根据式(1)～(3)确定：

式中：λ0——峰值波长；

n——反射膜堆层数；

d——膜厚；

m——干涉级数；

Tmax——峰值透射比；

T12——反射膜的透过率；

A12——反射膜的吸收损耗；

2Δλ——半宽度。

由式(1)～(3)可知，调整反射膜的膜堆层数及膜厚可实现特定的峰值波长；选择高透过率的全介质膜可以提高膜层的透射比，但会导致半宽度增大。为兼顾峰值透射比及半宽度，设计的膜系具体结构为G(HL)3H(2L)(HL)3H，如图1所示。

图1 酶标分析仪波长标准物质膜系结构示意图

3 制备工艺

3.1 镀膜材料的选择

硫化锌和冰晶石具有良好的光学性能，而且二者均有稳定的结构，容易保持制作器件的长期稳定性。硫化锌折射率为2.35，透光范围为400～13 000 nm，具有良好的应力和良好的环境耐久性，堆积密度高，呈压应力；而冰晶石（Na3AlF6）折射率为1.35，透光区130～14 000 nm，堆积密度低，呈张应力。硫化锌和冰晶石两者搭配起来镀多层膜应力很小，因此选择硫化锌和冰晶石作为波长标准物质的镀膜材料。

作为标准物质基底材料，除了应具有良好的光学稳定性和化学稳定性之外，更重要的是其力学性质。一方面基底与薄膜材料要有良好的结合力，确保薄膜不脱落不开裂；另一方面需要基底的热参数与薄膜膜系匹配。可供选择的基底材料有熔石英、微晶玻璃、K9玻璃等。实验发现，K9玻璃透过率好、硬度高、膜层附着力优良，适合作为波长标准物质的基底保护材料。

3.2 基片制备

经光学冷加工即切割、粗磨、精磨、抛光等工艺加工基片材料，再经镀膜工艺将K9玻璃镀在基底表面。

3.2.1 切割

用外圆排锯切割机进行光学切割，烧结金刚石锯片基体为45#钢，厚度为0.3 mm，金刚石粒度为210～255 μm；切割时控制线速度为20～40 m／s，在锯片边缘添加粒度为60～80 μm金刚砂及水，以防止锯片过热并提高切割效率，最终切割成30 mm×10 mm的光学玻璃基片。

3.2.2 研磨

以研磨机将玻璃基片研磨成精确厚度的标准物质基片，一般磨除量为0.2～1.0 mm。由于光学玻璃基片的凹陷深度随磨料颗粒度的增大而增加，即研磨质量随粒度增大而变坏，因此开始研磨时，要用粒度较大的磨料提高玻璃的磨除量，之后再用细磨料逐级研磨，使得玻璃表面的凹陷层和裂纹层的深度尽可能减小。根据抛光表面的质量要求，最后一级研磨的玻璃凹陷层平均深度为3～4 μm，最大裂纹深度为10～15 μm。

将粘盘加热，用石蜡或松香蜡将玻璃基片粘接于粘盘上，依次采用粒径为40,25 μm的金刚砂作为磨料，在研磨机上进行研磨，研磨机的转速设为70 r／min，直至光学玻璃表面的毛面变得非常细致。

3.2.3 抛光

经过粗磨和精磨后的的玻璃基片表面有凹陷层，下面有裂纹层，经研磨的玻璃基片是不透明的，必须抛去10～15μm的裂纹层，获得符合理论要求的标准物质基片。

抛光过程在抛光机上进行，调节抛光机转速为35～100 r／min，顶盘用毛毡粘于细铁盘上，用石膏加水，将基片毛坯粘在底盘上。粘合前，须先检查基片表面细磨程度，避免附有砂孔等缺陷而影响抛光质量。粘合后先用粒径25 μm的金刚砂细研磨，直到用放大镜检查符合要求后，用水冲洗，换用红粉抛光。研磨时室内温度必须保持在20℃以上，玻璃表面的温度保持在约25℃。

3.2.4 清洗

为了提高膜层的附着力和光学性能，采用定向离子清洗技术有效去除K9玻璃基底的二次污染、增加基底表面结合能，有效改善基片表面性质。

3.3 镀膜

镀膜机的钟罩上安装有卤素灯，波长涵盖紫外到红外波段，采用极值法进行膜厚度监控。光束射入钟罩，通过基片从钟罩射出，经单色仪分光后被光电倍增管接收，光电流由放大器检测，以监控膜层厚度。单色仪用于控制波长。硫化锌和冰晶石分别放在两个钼片制成的加热舟内，镀膜时以H层、L层交替加热进行蒸发。

为保证标准物质的性能，采取如下措施：

（1）采用大型修正挡板修正膜层的径向均匀性，通过提高夹具的旋转速度，修正角向均匀性，保证同一标准物质不同位置的中心波长在规定的范围之内。

（2）由于膜层中包含大量的空隙，薄膜滤光片吸潮后膜层折射率升高，滤光片的中心波长会产生明显的漂移。采用离子束辅助蒸发的方法得到高堆积密度的薄膜，以减小标准物质的波长漂移。

（3）采用光学直接监控法控制膜层厚度，前一层薄膜产生的厚度误差可以被后一层薄膜的反向偏差所补偿，提高标准物质的精度和稳定性。

（4）采用胶合强度高、收缩率小、耐高低温的光学环氧树脂胶作为标准物质胶合用的光学粘结剂，并在膜层上胶合K9平板玻璃，以防止膜层划伤并提高膜层的稳定性。

4 定值

按照JJG 1034–2008中“7.3.3”条，仪器开机预热30 min，校正仪器波长及透射比量值，对酶标分析仪波长检定用滤光片标准物质进行逐片定值［7］。将标准物质置于仪器样品室，以50 nm／min的扫描速度测量标准物质的峰值波长，连续测量9次，取9次测量平均值作为标准值。

使用紫外可见近红外分光光度计对所制备的系列标准物质在300～700 nm范围内进行扫描，得到谱图见图2。

图2 酶标分析仪波长标准物质光谱曲线图

由图2可知，所研制的酶标分析仪波长标准物质标称峰值波长依次为405.0，450.0，492.0，620.0 nm，峰值透射比大于25%，半宽度小于15.0 nm，满足规程要求。

5 不确定度分析

测量不确定度是表征被测量之值的分散性，并与测量结果相联系的参数。测量不确定度由多个分量组成，其中一些分量可按统计分布来评定，以实验标准偏差表征［8］。酶标分析仪波长标准物质峰值波长的测量不确定度主要由重复性、均匀性、稳定性、定值仪器引入的不确定度确定。

5.1 重复性引入的不确定度u1

用定值装置分别测试波长标准物质的峰值波长，重复测量6次，计算6次测量结果算术平均值的相对标准偏差，作为重复性引入的标准不确定度u1，计算得u1=0.04 nm。

5.2 均匀性引入的不确定度u2

将测试仪器预热、调节完毕，根据JJG 1006–1994及JJG 1034–2008 “7.3.3.3”，分别按照标称波长上下20 nm的扫描范围及50.0 nm／min的扫描速率测试5套样品不同位置（样品的中心点、中心点上下各5 mm处共3点，以上3点左右2 mm处各1点）峰值波长及峰值透射比值，并计算半宽度，每个取样点连续检测3次，对峰值波长数据采用方差分析法进行统计处理［9–10］，方差分析结果见表1。

表1 标准物质均匀性考核结果

由表1可知，F

5.3 稳定性引入的不确定度u3

在规定的贮存或使用条件下（12个月），按照先密后疏的原则，定期进行特性量值的稳定性检验。根据直线拟合法评价标准物质的稳定性。根据实验结果，计算得斜率β1=-0.003 7，截距β0=491.1577，直线标准偏差s2=0.013 7，斜率的标准偏差s(β1)=0.026 0。

查表可知t0.95，4=2.78，则t0.95，4·s(β1)=0.072 3，显然，t0.95，4·s(β1)>β1，表明直线斜率不显著，标准物质在考察期是稳定的。

在稳定性考察期12个月内（X=12），标准物质的稳定性引入的不确定度分量u3= s(β1)·X=0.32 nm。

为了保证标准物质的稳定性，采用特制的包装盒进行包装，非使用状态应将标准物质置于包装盒内，与包装盒一同放入干燥器中，贮存于避光、阴凉、洁净的环境中。

5.4 定值仪器引入的不确定度u4

定值仪器的波长扩展不确定度为0.07 nm(k=2)，由定值仪器引入的标准不确定度u4=0.035 nm。

将以上不确定度分量合成，得：

扩展不确定度U=kuc=0.66 nm≈0.7 nm （k=2）。

6 结语

经均匀性、稳定性考核，酶标分析仪波长标准物质均匀、稳定，量值准确，符合国家二级标准物质的要求，能满足酶标分析仪波长示值误差及重复性的检定／校准需求。

［1］郭勇.医学计量［M］.北京：中国计量出版社，2002: 44.

［2］叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程［M］. 2版.南京：东南大学出版社，1997: 208–209.

［3］倪星忠.临床生化酶试剂方法［M］ .上海：华东师范大学出版社，1993: 127–128.

［4］JJG 861–2007 酶标分析仪检定规程［S］.

［5］JJG 812–1993 干涉滤光片［S］.

［6］王文光.分光光度计检定用高稳定度窄带干涉滤光片的研制［J］.计量与测试技术，2000(1): 33–34.

［7］JJG 1034–2008 光谱光度计标准滤光器［S］.

［8］JJF 1059.1–2012 测量不确定度的评定与表示［S］.

［9］JJG 1006–1994 一级标准物质技术规范［S］.

［10］JJF 1343–2012 标准物质定值的通用原则及统计学原理［S］.