犬感染犬瘟热病毒后抗体的产生规律及检测方法

苏贵龙， 李建喜

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050)

犬感染犬瘟热病毒后抗体的产生规律及检测方法

苏贵龙， 李建喜*

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050)

摘要由犬瘟热病毒引起的犬瘟热(Canine distemper, CD)疾病，是造成犬及部分食肉目动物的一种具有高度传染性和高死亡率的疾病。犬瘟热病毒感染犬产生抗体的规律在临床上具有非常重要的意义。幼犬在出生后约35 d就失去了母源抗体的保护，需要人工对其进行预防免疫，以获得针对该病毒的特异性抗体。犬瘟热病毒在进入机体后，引起以胸腺依赖性的B2细胞所介导的体液免疫为主，初次免疫应答产生的IgM稍多于IgG，再次免疫应答时记忆性B细胞发挥着主要的作用，在很短时间内使得特异性IgG抗体达到较高水平，且在机体内维持很久的时间。通过掌握IgM和IgG抗体产生的量及变化规律，可以诊断疾病发生的过程，为疾病的治疗和预防提供诊断依据。

关键词犬瘟热病毒;IgM;IgG;产生规律;检测方法

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)，属于副粘病毒科麻疹病毒属，是负链单股不分节的RNA病毒[1-2]。犬瘟热病毒(CDV)主要由核衣壳蛋白N、磷蛋白P、基质膜蛋白M、融合蛋白F、附着或血凝蛋白H、大蛋白L这6种蛋白组成[3]，其中核衣壳蛋白N、融合蛋白F以及血凝蛋白H是犬免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原，核衣壳蛋白N则是保守性较强的免疫原性蛋白。病毒颗粒表面的抗原决定簇，即抗原表位，大多也由N蛋白所决定。H、F、N在犬瘟热免疫方面起着非常重要的作用[4]。Cherpillod P等[5]研究发现N蛋白和犬瘟热病毒CDV的毒力关系非常密切，犬瘟热病毒在持续感染中枢神经系统时，N蛋白就发挥着重要的作用。N蛋白能够刺激机体产生比较强烈的抗体反应。很多的单克隆抗体就是根据N蛋白生产的[6]。

1犬瘟热病毒感染犬产生体液免疫应答的过程

B细胞介导的体液免疫，大致分为2类：一类是不依赖于T细胞的B1细胞所介导的，主要针对细菌的脂多糖和肺炎链球菌多糖等抗原，但是机体内发生的体液免疫应答主要以T细胞依赖性的B2细胞所介导，犬瘟热病毒进入机体后产生的就是该类型的体液免疫应答过程。

犬瘟热病毒进入机体后，引起的以T细胞依赖性体液免疫可分为以下阶段：识别阶段、反应阶段和效应阶段。初次应答时，抗原进入机体后，树突状细胞等具有加工、递呈作用的细胞首先会包裹病毒，并暴露表面的抗原决定簇，然后将暴露出抗原决定簇的病毒交给T细胞。同时，抗原与B细胞表面BCR(BCR为B细胞表面免疫球蛋白)结合，结合后释放第一信号。T细胞在接受抗原刺激的情况下，会分化为辅助性T细胞，通过细胞表面的一些病原相关模式蛋白及细胞因子与已经结合抗原的B细胞接触，释放第二信号，与B细胞发生相互作用，使得结合在B细胞BCR上的抗原最终被活化。此后，B细胞在生发中心大量克隆，发生抗体V区的亲和力选择，保留亲和力强的B细胞克隆。增殖完成后，B细胞开始分化，生成浆细胞，然后在不同细胞因子的调节下分化成不同的IgE、IgM、IgG等抗体。其中，最先生成分子量大的五聚体IgM。

记忆细胞的产生：初次免疫应答结束时，很多亲和力差的B细胞就凋亡消失，一些B细胞在淋巴结皮质区内被抗原和辅助性T细胞激活而转移至骨髓，但是一些记忆前体细胞诱导附近T细胞的CD145分子表达，促使B细胞bcl-2分子表达，bcr-2可保护B细胞抵抗凋亡，使得B细胞分化成记忆细胞。分化的记忆细胞表面上有可与IgG结合的BCR受体，一旦再次接触抗原，便会分化产生大量抗体，而IgM记忆细胞的寿命较短，所以再次免疫应答主要由IgG记忆细胞产生浆细胞为主。同时，那些已经扩增的B细胞作为抗原递呈细胞可在MHC-2类分子作用下摄取并加工抗原，然后递呈给T细胞，与T细胞接触并相互作用，通过粘附分子及抗原递呈作用被激活并诱导分化[7]。

抗体的类型转化：原始B细胞结合了抗原后，在细胞因子的作用下逐渐生成免疫球蛋白的过程中浆细胞产生的免疫球蛋白会发生“类型转化”，即基因的重排，在重排过程中发生了基因缺失或RNA剪接而产生不同的抗体，缺失不需要的重链基因，在不同的细胞因子的作用下将可变区与邻近重链恒定区，即C区基因通过环出的方式相联接而形成不同的抗体，IgM也可以突变转化生成IgG，但是决定抗原特异性的可变区，即V区不发生变化[8]。

2感染犬瘟热病毒后犬产生抗体的规律

犬瘟热病毒初次刺激机体时，引起的体液免疫主要在淋巴结中产生，产生的抗体主要是IgM，其次为IgG，这个时期产生的抗体总量少，且维持时间短，产生抗体的亲和力也低，且潜伏期较长。但是，第2次刺激时就会大量产生IgG抗体，其原因是在第1次刺激时已经产生了大量的单克隆B细胞和记忆B细胞，当这些B细胞再次与抗原接触，会在很短的时间内与T细胞发生作用并被激活，以产生大量的IgG抗体，潜伏期很短，产生抗体的亲和力较高，抗体产生后维持时间也较长，总的抗体水平自然也比初次应答高很多。更重要的是，在骨髓中的记忆B细胞在受到抗原刺激时会迅速分化，以产生高亲和力、高效价的抗体。通过初次应答与再次应答的不同规律，可以很好地用于疾病诊断等其他临床用途。

乔贵林等[9]对犬进行免疫后，分别在14、28、42 d注射犬瘟热疫苗，观察产生抗体的情况，结果发现通过3次免疫机体就可以产生大量的抗体，并维持较长时间。另外，免疫程序和犬的年龄也与抗体的产生量有很大关系。老年犬因为免疫系统的感受性下降，免疫应答能力降低。于万海等[10]对犬分别于首免(6周龄)前1 d、二免(8周龄)前1 d、三免(10周龄)前1 d和三免后前1 d、60 d采血用中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测仔犬血清CD抗体的中和效价，进行不同剂量抗原刺激，观察产生的抗体量的变化，结果发现不同剂量的抗原刺激，产生抗体的量也会不同。相徳忠[11]对紧急免疫前后体内抗体的变化情况进行观察，发现犬在紧急免疫的情况下体内的抗体也呈现低-高-低的变化规律。

通过酶联免疫方法也可以检测体内抗体的变化，了解抗体在机体内的变化规律。Von Messling V等[12]以抗N蛋白单克隆抗体捕获重组杆状病毒表达的CDV的N蛋白作为抗原，建立了夹心ELISA的方法，用以检测犬血清中的CDV特异性抗体。这种方法与血清中和试验及RT-PCR试验相比有着较高的灵敏性和特异性，可用于对犬血清中抗体的检测，方便对抗体在犬体内的变化过程进行检测[12]。

3检测IgM和IgG抗体的实验室方法

临床实验室检测抗体的方法有很多，如中和试验和间接免疫酶染色法等[13]。其中，IgM采用酶联免疫捕获法、IgG采用间接法，能够比较准确反映体内抗体水平。捕获法测量IgM时，固相包被抗IgM抗体，然后将待测抗体加入，发生特异性地结合，再加入与IgM特异性反应的抗原、酶标抗体后加底物显色。采用间接法[14]测量IgG时，包埋物是能与IgG特异性反应的抗原，IgG与抗原结合后再加入酶标抗抗体、底物显色，就可以检测IgG。测量IgM时不用间接法的原因是特异性和非特异性IgG的吸附能力都很强，可以与抗原结合；而捕获法就可以避免这种情况，避免了假阴性的出现。

王琛[15]用ELISA检测犬五联苗高免血清中CDV抗体水平，以CDV的N蛋白为抗原，兔抗犬IgG为二抗，旨在证实将CDV的N蛋白导入大肠杆菌中表达后的蛋白可用于CDV的检测。对各环节在不同条件下的筛选进行比较试验，得到最佳条件：试验将纯化的CDV的N蛋白包被在1 μg/孔的酶标板，温度为4 ℃，过夜，用 10%兔血清进行封闭，酶标二抗最佳工作浓度为 1∶8 000 倍稀释，37 ℃条件下反应1 h。研究发现，CDV的N 蛋白检测 CDV 抗体时具有较高的特异性和灵敏度、抗原易纯化、重复性好等特点。

4犬瘟热抗体检测的临床意义

4.1预防免疫目前，预防犬瘟热病毒的办法主要有弱毒疫苗或者油乳剂灭活疫苗，采用疫苗免疫预防可以取得显著的成效[16]。研究发现，CDV母源抗体的半衰期为8.5 d。研究表明，幼犬母源性的IgG半衰期大约为8 d，猫为4.4 d[17]。

幼犬在出生后，需要一段时间才能健全其免疫系统，并且通过胎盘携带的母源抗体非常少，仅仅为3%的IgG抗体，它是唯一能通过胎盘的抗体，尽管IgG和IgM主要是在淋巴结和脾脏中产生，可是由于IgM为五聚体，分子量较大，不可以通过胎盘屏障。从开始吃母乳起，抗体滴度先有所升高，到6～8周滴度如果低于1∶20以下，则犬就极其容易感染犬瘟热病毒(CDV)，就需要及时进行免疫。但是，也不能过早地进行免疫，否则会因为母源抗体的存在，导致免疫失败。Heddle等[18]测定了母犬初乳及常奶(产后25～50 d)中免疫球蛋白成分的含量，并与血清中的含量进行对比，结果发现初乳中IgG抗体为血清中平均数的160%，而IgM较少，仅为14%。

临床上，对犬免疫程序也是根据抗体产生规律而制定的。体液免疫的初次应答和再次应答，是大量产生的B细胞以及产生抗体、发挥免疫作用的过程。初次免疫产生的抗体量较少，且特异性抗感染的IgG量少，需要进行第2次免疫，以产生较多的特异性抗体。记忆应答主要是记忆细胞快速大量分化、克隆扩增并产生抗体的过程。实施第3次免疫就可以发挥记忆细胞的作用，少量抗原的刺激即可将抗体维持在较高的水平，并且可以维持1年左右的时间。此外，也不能在短时间内连续免疫，以免免疫失败，从而影响了免疫效果。

表1　IgM和IgG临床检查用于疾病的诊断

李秋波等[19]以首次免疫后每隔20 d再免疫，观察抗体的变化情况。结果发现，实行3次免疫可以保证抗体的量维持较长时间。对于没有吃过母乳的幼犬，应尽早进行免疫。

4.2疾病诊断临床上，检测IgM、IgG具有非常重要的意义。由表1可知，根据IgM和IgG产生阳性及阴性的不同，可以用于疾病的诊断。其中，IgM对疾病的早期诊断具有非常重要的作用。另外，当胎儿脐带中检测到IgM时，表示有宫内感染。

5小结

犬瘟热病毒感染犬在临床上严重影响犬的健康，因此掌握犬瘟热病毒刺激犬产生抗体的规律对控制疾病的发生、及时诊断疾病等具有非常重要的临床意义。同时，犬瘟热单克隆抗体在临床上有重要的应用。比如，胶体金法检测CDV[20]采用的就是CDV制备的单克隆抗体，待测抗原通过与包埋的抗体结合，然后与另一个指示抗原结合，检测线T显色。质控线C为二抗，可以直接与包埋的抗体结合。层析技术在胶体金中的运用，使得待测物质和包埋的抗体均会流动至T线和C线，这样C线始终都可以显色，如果不显色则说明不能再使用该试纸条[21]，此方法操作简便，在临床上有广泛应用。

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中图分类号S852.65+5文献标识码A文章编号0517-6611(2015)30-116-03

基金项目公益性行业专项(201303040-15)。

作者简介苏贵龙(1988- )，男，甘肃平凉人，硕士研究生，研究方向：中兽医免疫与生物转化技术。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事中兽医免疫与生物转化技术研究。

收稿日期2015-09-07

The Rule of Canine Distemper Virus (CDV) Stimulate Dogs to Produce Antibodies and Its Detection Method

SU Gui-long, LI Jian-xi*(Lanzhou Institute of Animal Science and Veterinary Pharmaceutics of CAAS, Lanzhou, Gansu 730050)

AbstractCanine distemper, caused by canine distemper virus, is a disease that causes carnivore animals highly contagious and high mortality. Puppies lost the protection of the maternal antibody after being borned in about 35 days. By that time, the artificial immune to their prevention is needed, so that they can obtain the specific antibodies against the virus. After the canine distemper virus enters the body, the humoral immunity mediated by the thymus dependent B2 cells is caused. For the first time of the immune response, IgM is produced slightly more than IgG. For the second time of the immune response, memory B cells play a major role, it makes specific IgG antibody achieve a higher level and maintain longer in a short time. The disease process can be diagnosed by grasping the amount of IgM and IgG and its change rule, which provides the diagnosis basis for the treatment and prevention of the disease.

Key wordsCanine distemper virus; IgM; IgG; Occurrence law; Detection method