氨基酸在柑橘汁非酶褐变过程中的影响和作用*

李申，马亚琴，韩智，朱攀攀，王珺

(西南大学柑橘研究所，国家柑橘工程技术中心，重庆，400712)

柑橘是世界第一大贸易水果，我国柑橘产量和种植面积均居世界第一。柑橘汁是柑橘产业的主要加工产品，橙汁是世界第一大果汁，世界橙汁年产量已达到2 500万t左右，占世界果汁产量的2/3以上［1］。柑橘汁富含糖类、抗坏血酸、柠檬酸、膳食纤维、矿物质以及多酚、黄酮、单萜、类胡萝卜素、香豆素等多种营养物质［2-4］。同时，柑橘汁中氨基酸种类齐全，以天门冬氨酸、脯氨酸、精氨酸以及谷氨酸含量最高，占总含量的56%以上;并含有7种必需氨基酸(不含甲硫氨酸)，必须氨基含量为6.85～32.12 mg/kg;同时含有甘氨酸、精氨酸等多种药用氨基酸;此外柑橘汁中还含有丰富的4-氨基丁酸，这种非蛋白氨基酸具有调节血压，减少中性脂肪的作用［5-7］。越来越多的研究表明，氨基酸不仅可以作为蛋白质合成的底料，为机体提供能量，而且包括精氨酸、色氨酸、亮氨酸以及苏氨酸在内的多种氨基酸及其代谢产物，在生物体的多种生命活动中起到调节作用，影响机体内分泌、免疫、神经、消化、基因表达等功能［8］。柑橘汁中还富含抗菌，抗肿瘤，抗过敏，抗氧化等功能的多种活性成分，因此可作为良好的消炎剂、防腐剂、同时也具有促进伤口愈合，延缓衰老等功能，并且对呼吸系统，泌尿系统和心脑血管系统均具有治疗或保健作用［9-10］。

果汁在加工和贮藏过程中易发生褐变，酶促褐变和非酶褐变是导致果汁褐变的两大因素，其中非酶褐变是导致柑橘汁褐变的主要方式。非酶褐变产生黑褐色物质及一些中间产物，如糠醛、5-羟甲基糠醛(5-HMF)、2，5-二甲基-4-羟基 3(2H)-呋喃酮(DMHF)等，是引起果汁外观、风味和营养价值劣变的主要原因［11］。

影响橙汁褐变的因素众多，包括:氨基酸、抗坏血酸、有机酸、酚类物质、糖等营养成分;温度、氧气含量等环境因素;以及金属离子，化学抑制剂，加工方式等其他因素。Joslyn［12］分层次详细综述了橙汁中营养成分，以及温度、氧化还原添加剂等因素在贮藏过程中对褐变的影响，并分析和总结了褐变产物的性质。柑橘汁作为一个复杂的体系，糖类、氨基酸、柠檬酸、抗坏血酸等成分以不同程度促进褐变。目前，氨基酸影响褐变的机理尚未完全明确，主要涉及氨基酸作为亲核试剂对糖类分解的促进或抑制作用以及氨基化合物与抗坏血酸及其降解产物的聚合作用等。研究表明，氨基酸的种类显著影响褐变趋势，精氨酸和4-氨基丁酸能快速促进褐变，但丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸在2周内不会引起果汁褐变［13］。而柑橘汁中其他组分也可能作为抑制剂延缓褐变，如酚类物质能抑制游离氨基酸和抗坏血酸的降解;果胶降低分子流动性，使果汁体系的黏度上升，进而延缓褐变反应［14］;低浓度的半胱氨酸能显著抑制5-HMF、DMHF的产生以及抗坏血酸的降解，进而抑制褐变的产生，N-乙酰基-L-半胱氨酸也有类似的作用［15］。随后，通过对不同抗氧化剂抑制贮藏柑橘汁褐变效果的分析比较，发现抗坏血酸作为抗氧化剂的添加量要与溶解氧的含量成正比，否则其自动氧化的性质会导致褐变加剧，同时指出5-HMF不能作为柑橘汁褐变的指示物［16］。随着研究的深入，越来越多的研究表明柑橘汁褐变以多因子，多途径、多元化的交互作用进行。在此基础上，Bharate［17］等人较为全面综述了柑橘汁在加工和贮藏过程中非酶褐变所涉及的化学变化、颜色变化、中间产物、褐变指示物、检测方法以及褐变的抑制方法等，并建议将DMHF作为指示柑橘汁褐变的指标物质。

影响柑橘汁褐变因素非常复杂，而柑橘汁本身亦是复杂的褐变体系，但为了研究不同成分对柑橘汁褐变的影响，针对某一组分对褐变影响的研究非常必要。氨基酸对贮藏柑橘汁褐变的影响作用呈现多样性，基于上述研究，本文就氨基酸参与非酶褐变的机理，以及氨基酸对褐变的促进作用等方面进行总结综述，旨在为氨基酸引起柑橘汁褐变机理的深入研究提供一定的参考。

1 氨基酸参与非酶褐变的反应机理

非酶褐变是柑橘类产品加热和长时间贮藏过程中对其品质和颜色改变影响最大的化学反应之一［18］。已知的柑橘汁中非酶褐变的化学过程主要包括以下几种反应机制:美拉德反应、焦糖化反应、抗坏血酸反应、多酚氧化缩合反应，在柑橘汁中还原糖、氨基酸和抗坏血酸是非酶褐变的主要底物［19-22］。其中，美拉德反应是果汁加热以及长期贮藏过程中褐变的重要原因［23-24］。抗坏血酸的降解普遍被认为是柑橘汁贮藏过程中导致褐变发生的主要反应［11，25-26］，氨基酸被认为是诱发褐变的重要原因，酚类物质的存在也会导致果汁褐变［27-29］。

1.1 美拉德反应

美拉德反应是还原糖类与氨基化合物如游离氨基酸、肽和蛋白质上的氨基发生羰氨基反应，经一系列重排、脱水、缩合及聚合反应生成黑褐色物质，该反应是一个连续并相互联系的复杂过程，在食品加热和贮藏中广泛存在［24，30］。John Hodge［31］等人将这个反应正式命名为Mailard reaction，并对该反应过程进行了描述和归纳。Danehy，Martins以及郑文华［32-33］等人对该反应进行了补充和发展。Buera［34］等人证明并强调了美拉德反应在果汁褐变中的重要性，但由于柑橘汁的酸度较高，Clegg［11］等人认为美拉德反应类型的糖-氨基酸反应对柑橘汁褐变的作用较小。为了更加清晰地描述非酶褐变的反应过程及各阶段的特点，对这一反应过程以图1［35］的形式进行了系统的归纳总结，其反应过程可分为初始阶段、中间阶段和末期阶段，包括糖胺缩合、分子重排、重排产物3种不同途径的降解、多羟基不饱和物的反应等过程，其反应历程见图1。

图1 美拉德反应历程示意图Fig.1 Schematic of Maillard reaction process

氨基酸作为柑橘汁中参与美拉德褐变反应的重要反应物，其作用重要并具有多样性，其氨基基团在反应中起到亲核试剂的作用，能加速糖类分解从而促进黑褐色素形成［36］。同时，氨基化合物的性质影响美拉德反应的速率，通常认为碱性氨基酸具有高褐变活性，包括氨基乙酸、色氨酸、赖氨酸和酪氨酸;半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸被认为是低褐变活性氨基酸;其中，赖氨酸具有2个氨基，被证明是褐变反应活性最高的氨基酸，其模型褐变程度是其他氨基酸模型的2～3倍，其活性是其他氨基酸的5～15倍［37-38］。

1.2 抗坏血酸降解

抗坏血酸是果汁的主要营养成分之一，其降解反应被认为是柑橘汁贮存过程中质量劣变的最重要的反应［26，39］，氨基酸对该反应的加速作用也已被证实［11-12］。

抗坏血酸兼具酸性和还原性，极易氧化分解，并自发向形成有色物方向逐渐变化，其分解在有氧和无氧的环境下都可进行，并以多种途径参与果汁的褐变。有氧时，抗坏血酸被氧化形成脱氢抗坏血酸(DNA)，此时几乎不产生褐色［11，40-41］。DNA 以酮式互变异构体转换并历经重排而形成DKG，DKG经C4的β-消除开始脱羧，同时会有酮木糖产生，此时反应呈现出非酶褐变的特征，酮木糖进一步降解形成还原酮，然后降解形成糠醛和2-呋喃羧酸，这些化合物可以与氨基酸结合，形成褐色色素(图2)，导致果汁褐变［42-43］。厌氧条件会阻碍抗坏血酸转化为DNA，但如果DNA已在果汁中形成，厌氧条件比有氧条件更有利于褐变的发生［44］。在酸性条件下(pH＜4.0)，抗坏血酸的降解产物主要是糠醛［45-46］，糠醛可以发生聚合反应，在果汁中与氨基酸结合促进果汁褐变，同时果汁中的部分氨基酸能直接与抗坏血酸发生较快的化学反应引起褐变，氨基酸的R基团与抗坏血酸分子发生反应，R基团中含氨基或苯环的氨基酸与抗坏血酸反应最迅速，其余的反应速率较慢，非极性R基团与抗坏血酸的反应极慢，半胱氨酸通过抑制抗坏血酸的降解，进而延缓褐变。同时抗坏血酸的氧化褐变也受体系酸碱度的影响，当体系的pH值为4.0时，抗坏血酸氧化褐变速率最快，当体系的pH值为2.0 时，抗坏血酸氧化缓慢［47］。

图2 抗坏血酸降解途径Fig.2 Ascorbic acid degradation pathway

1.3 焦糖化反应

在果汁加工和贮藏过程中，糖类不仅参与美拉德反应，部分也会进行焦糖化反应。焦糖化反应是糖类在没有氨基化合物存在的情况下，当加热温度超过它的熔点时，发生脱水或降解，然后进一步缩合生成黏稠状的黑褐色物质的反应［48］。高温、高糖浓度均能促进焦糖化反应的发生［49］。在酸性果汁中，由于加热作用使糖类脱水形成糠醛和5-HMF，进而与果汁中氨基化合物继续参与美拉德反应最后阶段的聚合反应生成类黑精色素。

1.4 多酚氧化缩合反应

多酚类化合物化学性质活泼，容易氧化成酮，其亲电子基团极易与亲核物质反应，从而促进自身快速聚合及其他分子氧化。在果汁中，多元酚可进行自身氧化缩合反应或与果汁中某些化合物进行共呈色作用［29］。同时多元酚可氧化成醌类物质，并与氨基酸、蛋白质或酚类物质相互作用，发生褐变反应［50］。

2 氨基酸在柑橘汁非酶褐变过程中的作用结果与分析

大量的研究证实天然氨基酸会加速柑橘汁的风味损失，加速柑橘类产品的非酶褐变［11-12，51］。柑橘汁在贮藏过程中，糖类，氨基酸和抗坏血酸的热降解能产生异味和非酶褐变产物，氨基酸以及其他氨基化合物会加速褐变，特别是精氨酸和脯氨酸［12-13，28］。通过橙汁褐变模型(图3所示)［48］探究抗坏血酸、氨基酸、糖类等营养成分以及褐变产物对褐变的影响及影响程度，其研究结果表明，抗坏血酸的降解是导致橙汁褐变最重要的原因，褐变产生3-羟基-2-吡喃酮(3OH2P)、糠醛、5-羟基麦芽酚和2-糠酸等物质被证实为非酶褐变降解产物;氨基酸不存在的条件下，含有5-HMF、5-羟基麦芽酚和2-糠酸的橙汁模型溶液颜色不发生改变，精氨酸和脯氨酸对非酶褐变的促进作用尤为显著。

图3 柑橘汁贮藏过程中成分的变化以及褐变现象Fig.3 Changes in components and browning during storage of orange juice

2.1 氨基酸与糖类的相互作用

美拉德反应是导致果汁褐变，尤其是浓缩汁褐变的重要原因。果汁在高温浓缩过程中，氨基氮与糖类发生美拉德反应，生成黑色物质［52］。Wolfrom［28］模拟浓缩橙汁体系，在65℃氮气环境下，以490 nm处吸光度作为褐变指标检测反应初期的褐变程度，研究美拉德反应系统中糖、氨基酸等组件的作用以及影响因素(结果见表1)。结果表明D-葡萄糖和氨基酸，特别是4-氨基丁酸和精氨酸，是导致浓缩橙汁贮藏过程中褐变产生和品质降低的重要原因。利用阳离子交换树脂技术可去除柠檬汁中约96%的氨基酸，贮藏9个月后，未经阳离子交换处理的柠檬汁总糖含量减少0.97%，而其对照组柠檬汁中总糖含量仅下降0.29%［54］。

表1 美拉德反应系统的影响因素Table 1 Influence factors of Maillard reaction system

2.2 氨基酸与抗坏血酸的相互作用

氨基酸被证实是抗坏血酸褐变系统的重要诱因。抗坏血酸的降解产物有多种，例如糠醛，3OH2P以及其羰基化合物，褐变最初的反应可能氨基化合物与抗坏血酸的降解产物之间的相互作用，随后彼此聚合或与氨基酸聚合生成褐变产物［13，20］。5-HMF是果汁中的主要降解产物，可以通过氨基酸结合加速果汁褐变，其含量与抗坏血酸的程度具有显著的相关性，也多次被建议作为柑橘汁褐变反应的指标物质［46，55-56］。由于真实橙汁体系非常复杂，因此对橙汁褐变的研究大多采用模拟橙汁体系开展。Joslyn［5］利用模拟橙汁体系，以色值为指标，在40℃下分别对抗坏血酸-氨基酸-糖系统和脱氢抗坏血酸-氨基酸-糖系统的褐变程度以及影响因素进行分析(见表2和表3)。

结果证明，在丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸和谷氨酸5种橙汁模型体系中，赖氨酸和谷氨酸对褐变程度影响显著。在贮藏初期，除抗坏血酸-丙氨酸模型外，抗坏血酸单独存在时要比其与糖和氨基酸的复合模型褐变速度快。甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸均能降低贮藏初期的褐变速度，其中谷氨酸抑制效果最显著。在贮藏后期，氨基酸的存在，尤其是赖氨酸，能显著促进褐变发生。同样，Shinoda［27］利用橙汁模型研究抗坏血酸与其他组分的相互作用对橙汁褐变的影响，结果表明氨基酸与抗坏血酸的降解产物DMHF是橙汁褐变的呈色物质，并建议将其作为褐变的指标物质，当柑橘汁中的柠檬酸或氨基酸被除去后，褐变度分别降低了40%至60%。

表2 抗坏血酸-葡糖糖-氨基酸褐变系统Table 2 Browning in ascorbic acid-dextrose-amino acid systems

表3 脱氢抗坏血酸-葡糖糖-氨基酸褐变系统Table 3 Browning in dehydroascorbic acidsugar-amino acid systems

2.3 氨基酸的其他影响

DMHF是柑橘汁褐变标记物质之一，其形成机理尚未得到证实，但其存在与鼠李糖显著相关。在柑橘类果汁中DMHF的积累与鼠李糖和精氨酸之间的相互作用具有一定关系，精氨酸是与鼠李糖发生反应的主要氨基酸，该作用存在于美拉德反应［57］。

柠檬汁通过阳离子交换树脂技术去除氨基酸后，其糖类、抗坏血酸、酚类等营养成分在贮藏过程中得到更好的保留，褐变得到有效的抑制，其糠醛以及羟甲基糠醛的含量仅增加了3.97、1.07倍，远小于未处理组的14.03倍和16.07倍;其褐变指数也仅为未处理样品的26.2%［58］。

褐变反应活化能的高低决定了褐变反应进行的难易程度，因此可以用来判断、解释不同果汁、不同条件下的褐变速率，而活化能的与果汁的成分如氨基酸、糖含量、Brixo以及pH等因素有关［59］。浓缩柑橘汁的褐变活化能在17.6～35.3 kcal/mol范围内，由于活化能较低，而容易发生非酶褐变，同时符合零级反应模型［59］。

3 结论及展望

综上所述，氨基酸作为重要的营养成分，具有很高的营养价值以及药用价值，在柑橘汁褐变过程中主要是起到刺激和诱导作用，其作用机理以及降解产物尚未完全明确。氨基酸能够促进5-HMF生成，加快抗坏血酸降解和焦糖化反应，参与美拉德反应，其中精氨酸和脯氨酸促进褐变的作用最显著。此外，部分氨基酸具有抑制褐变的作用，如半胱氨酸可作为添加剂用于抑制褐变。

非酶褐变主要是由于含有α-羰基、α-羟基、以及α-氨基的化合物之间发生聚合、裂解、重排等反应转化为不饱和的聚合物。非酶褐变发生的机理非常复杂，其部分反应途径以及反应产物尚未确定，有待进一步深入研究。非酶褐变导致柑橘汁中氨基酸、抗坏血酸等成分的严重损失，同时影响食品的风味、色泽、营养等，其中间产物繁多，产生的醛和环氧化合物等对食品的稳定性和安全性带来极大的危害和隐患。因此，在食品加工中应通过褐变的有利作用来改善食品的色泽和风味，同时要尽可能抑制和减少不利褐变的发生。

非酶褐变对柑橘汁的营养价值及感官品质产生的影响是不容置疑的，同时还造成巨大的经济损失，是柑橘加工和果汁行业发展的制约因素。现有的研究以探究果汁自身的理化指标、褐变指标及褐变产物等来评价对果汁褐变的影响及影响程度，但是褐变并没有得到有效的控制。目前主要应用控制加工贮藏的环境因素(温度、氧气浓度、光照等);离子交换处理技术(去除氨基酸、蛋白质等);添加抑制剂(亚硫酸盐、巯基化合物、抗坏血酸及其衍生物等)等方法延缓柑橘汁褐变。影响果汁褐变的因素涉及贮藏环境、包装材料、加工工艺等多方面，因此，控制果汁褐变应综合考虑多种影响因素，综合多种方法，寻求一种安全、经济、有效的途径来有效解决柑橘汁及其他果汁非酶褐变的问题。

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