沉默热休克蛋白27基因增强大肠癌细胞对5-FU化疗敏感性

黄崇杰，刘长宝，郑晨果，蔡锚

（温州医科大学附属第二医院 肛肠外科，浙江 温州 325027）

·论 著·

沉默热休克蛋白27基因增强大肠癌细胞对5-FU化疗敏感性

黄崇杰，刘长宝，郑晨果，蔡锚

（温州医科大学附属第二医院 肛肠外科，浙江 温州 325027）

目的：探讨不同大肠癌细胞热休克蛋白（HSP27）蛋白表达水平及其与5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗敏感性的关系，同时通过RNA干扰抑制HSP27基因的表达，初步探讨沉默该基因对5-FU抗肿瘤作用的影响。方法：Western blot法检测各大肠癌细胞中HSP27蛋白的表达水平，CCK-8法测定不同浓度5-FU对各细胞株的抑制率，分析各组细胞HSP27蛋白表达水平与IC50的关系。设计合成3对针对不同靶点的HSP27小干扰RNA，通过脂质体转染SW480细胞，激光共聚焦显微镜观察转染效率，Real-time PCR及Western blot法检测转染后HSP27 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测HSP27-siRNA对细胞的生长抑制作用及沉默HSP27基因细胞对5-FU化疗敏感性的变化。结果：各组细胞中HSP27的表达水平与5-FU的敏感性呈负相关性。Real-time PCR及Western blot法结果显示有两对靶向HSP27-siRNA能有效抑制HSP27 mRNA及蛋白水平的表达；CCK-8法检测结果显示HSP27-siRNA转染可增强SW480细胞对5-FU的敏感性，半数抑制浓度（IC50）明显下调。HSP27在大肠癌细胞中的表达水平与5-FU化疗药IC50值呈正相关。结论：靶向HSP27的siRNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达，增强5-FU化疗药物的敏感性。

结直肠肿瘤；热休克蛋白27；5-氟尿嘧啶；RNA干扰

大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来发病率呈逐年上升趋势[1]。治疗上以外科手术为主，但对中晚期的患者，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）为基础的化疗方案成为必需的辅助治疗，然而肿瘤细胞内在的或获得性耐药是化疗失败

并导致肿瘤复发的主要原因[2]。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）27是HSP家族中的重要一员，最近的蛋白组学研究表明，其在结直肠癌中呈现过表达，且与化疗耐药和预后不良存在必然联系[3]，亦有国外文献报道，5-FU能够诱导HSP27表达从而促进细胞生存，抑制5-FU疗效[4]，但其耐药机制尚未阐明。本研究首先探讨了不同大肠癌细胞HSP27蛋白表达水平与5-FU化疗敏感性关系，筛选出高表达HSP27的细胞后，通过RNA干扰抑制HSP27基因的表达，并初步探讨沉默该基因对5-FU抗肿瘤作用的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 人结肠癌细胞SW480、LOVO、HT-29、LS-174T购自中科院上海分院，我院实验室常规保存；氟尿嘧啶干粉剂（5-FU）购自德国默克公司；RP-MI 1640培养基、优化培养基OPTI-MEMI、0.05%的胰酶、购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；β-actin鼠抗人抗体、兔抗人HSP-27抗体购自英国Abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司；CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒购自日本同仁化学研究所；转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；RT-PCR反转录试剂盒购自加拿大MBI fermentas公司；Real-time试剂盒购自日本Toyobo公司；HSP27 siRNA由上海吉玛公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：各细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，饱和湿度、37 ℃、5% CO2培养箱内常规传代培养。待细胞生长至约70%～90%的融合状态时用于实验。

1.2.2 药物配制：将10 mg的5-FU粉剂溶于1 mL 的37 ℃ PBS溶液中，配制成104 μ g/mL的母液，于-20 ℃冰箱保存备用；用不含血清的培养基稀释母液，配制成终浓度为10、20、40、80、160、320 μ g/mL的5-FU化疗药用于实验。

1.2.3 Western blot法检测不同种类结肠癌细胞HSP27蛋白的表达水平：取对数生长期状态良好，经胰酶消化收集细胞，离心弃上清，PBS漂冼2次，用含1% PMSF的RIPA细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA分析试剂测定样品总蛋白浓度，调整蛋白浓度，煮沸变性10 min。每组各取100 μ g总蛋白样品，以12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。将分离的蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS封闭2 h。兔抗人HSP27抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜15 min×2次后加HRP标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG（1∶500），常温孵育2 h，TBST洗膜15 min×2次。用增强化学发光法显色，X线片曝光显影。β-actin作为内参照标化蛋白质表达。用Quantity One凝胶成像分析系统进行半定量分析。

1.2.4 CCK-8法检测不同种类细胞对5-FU的敏感性：取对数生长期细胞，经胰酶消化吹打成单细胞悬液，调整浓度为5×104/mL，接种于96孔培养板中，每孔100 μ L，每组设8个复孔。实验分为空白调零对照组（不含细胞）、正常细胞对照组和5-FU药物终浓度为（10、20、40、80、160、320 μ g/mL）的5-FU组。细胞经24 h贴壁，更换成无血清培养基培养24 h进行细胞同步化，再更换成上述含药培养基继续培养24 h，每孔加入CCK-8试剂10 μL，培养作用1 h后用酶标仪于450 nm波长测吸光度值（A值）。取8孔平均值，计算抑制率（IR）。IR（%）=[1-（实验组A值-空白对照组A值）/（正常对照组A值-空白对照组A值）]×100%。

1.2.5 RNA干扰实验：

1.2.5.1 siRNA的合成及制备。HSP27 siRNA由上海吉玛公司设计合成，阴性转染对照siRNA及5’-FAM荧光标记对照siRNA为上海吉玛制药有限公司提供的通用阴性对照siRNA（见表1）。按照吉玛公司提供的siRNA使用说明书及实验指导进行，先将各对HSP27 siRNA及阴性转染对照siRNA分别溶解于Rnase-free ddH2O中，配成浓度为20 μmoL/L的母液，分装于小EP管中，-20 ℃保存备用。

表1 3对不同靶点的HSP27-siRNA及negative control siRNA序列

1.2.5.2 实验分组。5’-FAM标记的阴性siRNA转染实验分2组：①实验组：即转染5’-FAM标记阴性siRNA的SW480细胞；②正常对照组：未转染的SW480细胞。

靶向HSP27的siRNA转染实验分组：①3组不同转染实验组：即转染3对不同HSP27 siRNA的SW480细胞；②阴性转染对照组：转染negative controlsiRNA的SW480细胞；③正常对照组：未转染的大肠癌SW480细胞。

1.2.5.3 细胞转染。取对数生长期生长状态良好的SW480细胞，以2×105个细胞/孔，接种于无菌6孔培养板和激光共聚焦专用培养板，细胞融合达60%左右时，进行转染，转染前2 h更换为OPTI-MEMI优化培养基，用OPTI-MEMI培养基稀释siRNA，将稀释液和转染试剂LipofectamineTM2000混合，形成siRNA-转染试剂复合物，将其加入细胞中，siRNA终浓度为100 nmol/L，置培养箱中孵育6 h后，吸弃培养液，PBS洗涤3次，滴加抗荧光淬灭剂后进行激光共聚焦显微镜观察，以评估转染效率。或换10% FBS的RPMI 1640培养液继续培养48 h，收获细胞提取总RNA和总蛋白。

1.2.6 Real-time PCR检测基因转染后大肠癌SW480细胞HSP27 mRNA表达水平：上述细胞经培养48 h后，吸弃培养液，先用PBS洗涤2次，吸弃PBS后把6孔板置于冰上操作，采用Trizol RNA分离试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度。按照Promega试剂盒产品说明书操作合成cDNA后进行Real-time PCR反应，按照Toyobo公司的Real-time PCR试剂盒说明书（SYBR Green法）操作。HSP27上游引物：5’-AGGATGGCGTGGTGGAGA-3’，下游引物：5’-G GGAGGAGGAAACTTGGGTG-3’，扩增产物129 bp；内参照GAPDH上游引物：5’-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3’，下游引物：5’-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3’，扩增产物204 bp，均由上海生工合成。mRNA相对定量的计算方法：首先用Real-time PCR得到的目的基因Ct值分别与其相对应的内参的Ct值相减进行校正，得到目的基因的校正Ct值（△Ct），再以空白对照组中的平均校正Ct值作为本底参数，则目的基因的量：

每个实验重复3次取平均值。

1.2.7 Western blot法检测基因转染后大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达水平：将细胞接种于6孔板中，细胞分组同上，每组3孔，转染组按上述方法转染，48 h后收获细胞，提取总蛋白进行Western blot法检测，具体方法步骤（同1.2.3）。

1.2.8 HSP27-siRNA对SW480细胞存活率的影响：将对数生长期SW480细胞接种于96孔板，分为正常对照组、阴性转染对照组、HSP27 siRNA组，每组设5个复孔，设空白调零对照。转染组按前述方法进行转染（同上1.2.5.3），上述转染组细胞分别转染培养（0、12、24、36、48、60 h）后行CCK-8试验（具体步骤同1.2.4）。细胞存活率=（实验组A值-空白对照组A值）/（正常对照组A值-空白对照组A值）。1.2.9 siRNA干扰靶向抑制结肠癌SW480细胞HSP27表达对5-FU敏感性影响：将SW480细胞接种于96孔板，分为正常对照组、阴性转染对照组、HSP27 siRNA组，每组设5个复孔，转染组按前述方法进行转染，转染48 h后各组弃培养液，用PBS漂洗3次，去除未贴壁的死细胞，再加入不同浓度（10、20、40、80、160、320 μg/mL）5-FU的含药无血清培养基，继续培养24 h后进行CCK-8检测（具体步骤同1.2.4）。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0统计学软件，计量资料以±s表示，多组资料比较采用ANOVA单因素方差分析，组间两两比较方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnett’s T3检验，各细胞HSP27蛋白水平与半数抑制浓度（IC50）的关系采用直线相关性回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot法检测4种结肠癌细胞株中HSP27蛋白的表达水平 4种结肠癌细胞均能检测到HSP27蛋白的表达，但在不同细胞系中的水平存在一定差异。在SW480中表达最高，为1.38±0.06，LOVO最低，为0.77±0.04，且SW480细胞与其他各组细胞之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 HSP27蛋白在4种不同类型人结肠癌细胞株中的表达水平

2.2 不同种类大肠癌细胞株对5-FU的敏感性及与HSP27表达相关性分析 各组细胞经6个不同浓度的5-FU处理24 h后，CCK-8试剂盒法通过酶标仪检测OD值，分别计算细胞生长抑制率，不同组细胞对5-FU的敏感性用IC50值表示，结果显示（见图2）：各组细胞的IC50值存在较大差异，其中SW480细胞IC50均值（为102.43 μg/mL）最高，LOVO细胞（为50.25 μg/mL）最低，说明前者高表达HSP27细胞对5-FU化疗药物最不敏感，通过直线相关性分析显示各组细胞HSP27的表达水平与IC50值呈正相关性（R=0.959，P＜0.05）。

2.3 激光共聚焦显微镜观察转染效率 人大肠癌SW480细胞按上述方法转染带绿色荧光标记的阴性siRNA，6 h后于激光共聚焦显微镜下观察，通过计算发绿色荧光细胞数与同一视野下普通光镜细胞总数的比率测定转染效率在80%以上（见图3）。

2.4 Real-time PCR检测SW480细胞转染前后HSP27 mRNA的表达变化

2.4.1 扩增曲线和溶解曲线：图4所示目的基因和内参基因荧光PCR扩增曲线良好，绝大部分CT值在20～30之间，PCR扩增反应良好，溶解曲线均为单峰，PCR扩增特异性较好。

2.4.2 HSP27 siRNA对SW480细胞HSP27 mRNA表达的影响：人大肠癌SW480细胞按上述方法转染3对不同序列HSP27 siRNA、negative control siRNA或未转染正常培养48 h后，收集细胞进行Real-time PCR检测。各实验组细胞中HSP27相对表达量结果见图5。其中阴性转染对照组和正常对照组之间HSP27 mRNA相对表达量差异没有统计学意义（P＞0.05），siNRA-b组HSP27 mRNA的相对表达量为0.57±0.02，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；而siRNA-c组的相对表达量为0.31±0.01，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。表明siRNA-c组的干扰效果更好，在mRNA水平siRNA-c对靶基因HSP27抑制效率为69%。

图2 不同人结肠癌细胞株对应5-FU化疗药的IC50值及与HSP27表达的相关性

图3 激光共聚焦显微镜下荧光通道可见绿色荧光（×200）

图4 各处理组细胞HSP27及内参基因Rea1-time PCR扩增曲线和溶解曲线图

2.5 HSP27 siRNA对大肠癌SW480细胞HSP27蛋白水平表达的影响 见图6。siRNA-b组大肠癌SW480细胞中HSP27蛋白相对表达量为0.82±0.09，与正常对照组（1.45±0.12）比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；siRNA-c组的表达量为0.56±0.08，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；而阴性转染对照组和正常对照组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明HSP27-siRNA干扰能抑制细胞HSP27蛋白的表达，在蛋白水平siRNA-c组的抑制效率为57.9%。

图5 各实验组SW480细胞中HSP27 mRNA的相对表达量

图6 各实验组SW480细胞中HSP27蛋白水平的相对表达量

2.6 HSP27-siRNA对SW480细胞生存的影响 将上述3组细胞（正常对照组、阴性转染对照组、HSP27 siRNA组），分别培养（12、24、36、48和60 h）后，进行CCK-8试剂盒检测。结果显示，随着时间延长，阴性转染对照组、HSP27 siRNA组细胞存活均不同程度下降，前者分别为98.75±4.32、95.42±7.13、94.39±5.63、94.75±6.94、93.75±7.44，后者分别为96.43±6.51、94.37±5.82、94.01±6.21、92.53±7.48、89.11±5.47。两者与正常对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果表明终浓度为100 nmol/L的HSP27 siRNA可抑制SW480细胞生长，但不显著。

2.7 siRNA干扰靶向抑制结肠癌SW480细胞HSP27表达对5-FU敏感性的影响 HSP27 siRNA-c干扰组细胞在用5-FU处理后，细胞生长情况与阴性转染对照组和正常对照组相比明显受到抑制，IC50值与两对照组相比明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。结果提示靶向HSP27基因siRNA干扰可提高SW480细胞对化疗药物5-FU的敏感性。

表2 HSP27-siRNA靶向SW480细胞干扰对5-FU药物敏感性的影响（n=3，±s）

表2 HSP27-siRNA靶向SW480细胞干扰对5-FU药物敏感性的影响（n=3，±s）

与正常对照组和阴性转染对照组比：aP＜0.05

3 讨论

近年来随着人们生活节奏的加快及饮食结构的改变，大肠癌在我国的发病率和病死率已经呈逐年上升的趋势，发病率已跃居第3位，而病死率则位居恶性肿瘤死亡谱的第4位，并且有明显的年轻化趋势[5]。目前治疗上主要以外科手术切除为主结合辅助放化疗，以5-FU为基础的术后辅助化疗使淋巴结阳性的结肠癌患者的病死率有所降低，但是由结肠癌耐药引起的复发和转移仍然是进一步提高疗效的主要障碍[6]，因此进一步研究大肠癌细胞对5-FU的耐药机制、增强肿瘤细胞对5-FU化疗的敏感性迫在眉睫。

HSP又称应激蛋白，是指细胞在应激情况下所产生的一组序列高度保守的蛋白质，广泛存在于原核和真核生物中，应激状态下可被诱导表达。HSP27是小分子质量HSP亚家族的重要成员，目前国内外研究表明，其在肝脏、胃、结直肠等消化道肿瘤组织中异常高表达[7-9]，我们在前期研究中，已经证实HSP27在结肠癌细胞及裸鼠皮下移植瘤组织中呈高表达[10-11]。最近的蛋白组学研究表明，HSP27在结直肠癌中的过表达与化疗耐药和预后不良存在必然联系[12]。Wang等[13]对62例结直肠癌外科手术后行5-FU为基础化疗患者进行了6年的随访研究，结果发现肿瘤组织中HSP27高表达的患者，其化疗疗效较差。本研究通过Western blot法检测发现不同种类人大肠癌细胞中HSP27蛋白的表达水平存在一定差异，同时检测了各细胞株对5-FU的敏感性，证实了大肠癌细胞中HSP27蛋白的表达水平与5-FU化疗药物耐药存在必然联系，通过直线相关性分析显示各组细胞HSP27的表达水平与IC50值呈正相关性（R=0.959，P=0.041）。其中SW480细胞HSP27相对表达量最高，而对应的IC50值也越高，说明SW480细胞对5-FU出现明显耐药，应而在后续的实验中我们选择SW480细胞作为研究对象，通过RNA干扰抑制HSP27基因的表达，并初步探讨沉默该基因对5-FU抗肿瘤作用的影响。

RNA干扰是指在真核细胞中引入双链RNA分子从而导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉默的现象，该技术已成为分子生物学研究中最为活跃的热点之一。目前国内外进行的RNA干扰试验研究大部分是通过化学合成靶向某个基因序列的siRNA，通过特定的载体导入细胞内，最终达到沉默目的基因的过程。本研究中我们通过设计合成了3对针对不同靶点的HSP27小干扰RNA作为实验组，同时合成FAM荧光标记的阴性转染对照用于转染条件的优化和转染效率的检测。激光共聚焦显微镜观察其转染效率在80%以上，表明通过LipofectamineTM2000载体转染细胞的可行性，应用Real-time PCR及Western blot技术对各组细胞HSP27 mRNA及蛋白水平表达变化进行检测，结果表明设计的3对序列中有两对siRNA干扰序列能有效抑制HSP27的表达，其中以siRNA-c干扰效果最好，在mRNA和蛋白水平的抑制率分别为69.5%、57.9%，因而我们最终选择了siRNA-c干扰序列进行RNAi实验研究。我们将转染终浓度为100 nmol/L的HSP27 siRNA的SW480细胞培养12、24、36、48、60 h后，通过CCK-8试剂盒检测，计算细胞存活率分别为96.43±6.51、94.37±5.82、94.01±6.21、92.53±7.48、89.11±5.47，与正常对照组比较差异无统计学意义，表明终浓度为100 nmol/L的HSP27 siRNA可抑制SW480细胞生长，但不显著。进一步实验研究发现HSP27 siRNA-c转染的SW480细胞对5-FU的IC50明显下调，说明抑制HSP27表达后，可明显增加大肠癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性，降低5-FU的治疗浓度。

综上所述，我们认为HSP27蛋白在大肠癌细胞中的高表达与人大肠癌的发生、发展及耐药密切相关，大肠癌细胞中HSP27的表达与5-FU耐药呈正相关，靶向HSP27的siRNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达，抑制细胞生长，同时增强5-FU化疗药物的敏感性，该实验研究为临床上解决大肠癌细胞对5-FU化疗耐药基因靶向治疗问题提供理论依据。

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（本文编辑：吴健敏）

Silencing gene of heat shock protein 27 increases the sensitivity to 5-FU in colorectal cancer cells

HUANG Chongjie, LIU Changbao, ZHENG Chenguo, CAI Mao.Department of Colorectal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the relationship between the HSP27 expression level and the sensitization to 5-FU in different kinds of colon cancer cells, and then explore the effect of HSP27 gene down-regulated by siRNA interference, and the sensitive of 5-FU.Methods:The HSP27 expression level in different kinds of colon cancer cells were detected by Western blot, and the inhibition rates of different concentration of 5-FU were determined by CCK-8 method, then the relationship between the relative level and IC50of 5-FU was analyzed by Linear correlation.Three siRNA sequences targeted on special sequence of HSP27 gene were designed, All siRNAs were transfected by lipofectamine 2000.The transfection effciency was observed by laser confocal microscope.The expression of HSP27 was tested with qRT-PCR and Western blot analysis.Different concentrations of 5-FU were added to the cells, which were transfected with siRNA-HSP27 48 h before.Then, the inhibition rate was determined by CCK-8 after 24 h.Results: The correlation between the level of HSP27 expression and IC50were positive.Real-time PCR and Western blot revealed that two targeted HSP27-siRNA could effectively inhibit the mRNA and protein expression of HSP27.CCK-8 showed that the transfection of HSP27-siRNA can improve the sensitivity of SW480 to 5-FU and the IC50was downregulated signifcantly.Conclusion:The correlation between the level of HSP27 expression of colon cancer cells and IC50of 5-FU are positive.HSP27-siRNA leads to the effcient inhibition of HSP27 expression in SW480 cells, and increase the sensitization to 5-FU.

colorectal carcinoma; HSP27; 5-fuorouracil; RNA interference

R735.34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.006

2014-08-07

温州市科技局科研基金资助项目（Y20090436）。

黄崇杰（1987-），男，浙江温州人，住院医师，硕士。

刘长宝，主任医师，硕士生导师，Email：405120@ 163.com。