全基因组相关研究SNP多态性阳性位点与黑龙江省女性乳腺癌发病相关性研究

吴 桐1刘吉成1邱永强2李美谦1何 宁1李鸿梅1李喜春

全基因组相关研究SNP多态性阳性位点与黑龙江省女性乳腺癌发病相关性研究

吴 桐1刘吉成1邱永强2李美谦1何 宁1李鸿梅1李喜春3

目的检测前期GWAS研究中差异最显著的三个位点多态性与黑龙江地区汉族女性乳腺癌发病相关性。方法收集150例乳腺癌患者和300例年龄匹配且无乳腺癌家族史的健康体检者一般临床资料和5 ml外周静脉血，提取基因组DNA，PCR/sequencing方法基因分型，统计并比较两组研究对象各等位基因频率及基因型频率。结果各位点乳腺癌组和对照组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P＞0．05）；rs3006663，rs737495等位基因频率分布及基因型检测差异无统计学意义（P＞0．05）；rs6551328基因型分布在病例对照组中差异有统计学意义（P＜0．05），相对于CC基因型，CT杂合基因型的风险值OR＝1．776，95%CI为1．155～2．728，提示该位点CT基因型是乳腺癌发病的风险因素。结论rs6551328多态性与在黑龙江汉族女性乳腺癌发病相关。

乳腺癌，单核苷酸多态性SNP，易感位点，群体分布

乳腺癌是女性中排名首位的致病致死恶性肿瘤，近年来，乳腺癌发病呈年轻化趋势，严重威胁妇女的健康和生命。乳腺癌是由环境因素和遗传因素共同作用的复杂疾病。流行病学调查表明，乳腺癌的发病呈明显的家庭聚集现象，并在群体中表现出易感个体差异性和种族差异性，提示遗传因素在乳腺癌的发病过程中起到重要作用［1］。然而，乳腺癌发病遗传病因至今尚未明确，为乳腺癌的预防、早期诊断及治疗带来困难。近年来全基因组相关研究（GWAS）确定了大量的乳腺癌低共显性遗传易感位点，表明乳腺癌的遗传易感性主要可能与常见的低共显性易感基因和单核苷酸多态性位点（SNP）变异有关。这些易感基因和易感位点有望作为肿瘤标志物改善乳腺癌的风险预测及早期诊断，为确定高危人群、寻找预警标志物及个体化医疗提供理论依据。本文采用病例对照研究策略，选取黑龙江地区150乳腺癌病例和300例体检健康病例作为对照，通过检测前期GWAS研究中差异最显著三个多态性位点，探讨这些位点多态性与黑龙江地区乳腺癌易感性的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

本研究经学院伦理委员会批准，所有研究对象均自愿入组，签署知情同意书。乳腺癌病例选自黑龙江地区2013年1月～2015年1月临床收治汉族女性患者共计150例，（46.18±4.86）岁，为经病理组织学确诊患者；300例对照选自临床体检健康汉族女性，（44.92±5.21）岁。排除既往有放化疗史，其他肿瘤病史，自身免疫系统疾病史，精神病史，内分泌疾病史，职业暴露史，以及家族一级亲属患有乳腺癌、卵巢癌者，排除在黑龙江地区居住不满15年者。收集每名参加者外周静脉血5 ml，EDTA抗凝保存，以备分析。

1.2 位点筛选

研究位点为rs3006663，rs737495，rs6551328，三个位点，筛选自本研究室前期以乳腺癌为研究对象，应用Affimetrix SNP 6.0基因分型芯片（Affymetrix.Inc， 美国）完成的基于混合DNA全基因组相关研究结果，为病例—对照差异最显著三个位点，其P值依次分别为3.374×10-8，8.981×10-8，9.212×10-8。

1.3 基因分型

1.3.1 材料和试剂 全血基因组DNA提取采用血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，DP348-03），引物由北京博迈德基因技术有限公司合成，2×EasyTaq PCR Super Mix 购自北京全式金生物技术有限公司（AS111-12），DNA 测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.3.2 基因分型 本研究采用PCR/Sequencing方法鉴定基因型，全血基因组DNA提取采用血液基因组DNA提取试剂盒提取，经紫外分光光度计检测浓度和纯度，并将DNA工作液稀释至（50±2）ng/μl。利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，引物序列详见表1；PCR扩增体系为：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μl，2pM上下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，超纯水9.5 μl；扩增条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后，72℃最终延伸10 min。PCR产物测序。

表1 各位点引物序列

1.4 统计分析

PCR产物测序结果用DNAstar软件判读，Hardy-Weinberg平衡用Haploview软件计算，统计分析用SPSS 18.0软件分析， 基因频率和基因型频率分布用χ2检验分析。

2 结果

2.1 各位点Hardy-Weinberg平衡分析

经检验，各位点乳腺癌组和对照组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P＞0.05），说明研究对象在遗传学方面可以代表本地人群。

2.2 各位点基因型频率及基因频率分析

三个位点基因型频率分布见表2所示，位点rs6551328各基因型在病例、对照两组分布差异具有统计学意义。其中，三个位点基因频率分布未显示显著差异。

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球呈上升趋势，目前，全球每年约有120万新发乳腺癌病例，约有50万妇女死于乳腺癌，乳腺癌严重威胁着妇女的健康和生命。中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，且呈年轻化趋势。因此有必要在妇女人群中开展针对风险因素的评估，准确找到高危人群范围以便更好的进行针对性的预防指导。

乳腺癌的发生发展的致病机理目前尚不明了。在复杂疾病风险因素的研究中，全基因组关联分析（GWAS）成为一个非常行之有效的方法。GWAS通过对大量的病例对照及成千上万个SNP位点分析，评估在不同的染色体上的SNP位点与疾病的关系， 从而找出新的乳腺癌易感位点。在GWAS研究技术问世之前，研究人员已通过家系相关研究和候选基因途径等，筛选出某些与乳腺癌易感相关基因，但尽管这些基因与乳腺癌高风险有关，但这些突变在人群中非常少，也只能解释极小部分基于家系的乳腺癌患者的遗传病因学。GWAS技术的问世让我们找到了许多未曾发现的基因以及染色体区域，为复杂疾病的发病机制提供了更多的线索，通过GWAS研究筛选乳腺癌易感性单核苷酸多态性（SNP）成为乳腺癌遗传病因学的一个热点［2］。目前，国外对于乳腺癌易感位点的研究与验证多以欧美人群为研究对象，大量的乳腺癌低共显性遗传易感性位点，表明乳腺癌的遗传易感性主要可能与常见的低共显性基因的变异有关［3］。然而，目前尚不清楚低外显率等位基因的确切数目及其影响乳腺癌易感性的机制。

表2 各位点基因型频率及基因比较

而我国针对与乳腺癌相关的各种危险因素（流行病学危险因素、乳腺病理危险因素和相关生物标志物检测）已经进行了较多的研究，但对于乳腺癌的易感位点的发现及基于易感位点建立风险预测模型研究尚处于起步阶段。仅Zhangwei等人通过对7 531例乳腺癌患者和3 998例健康对照者进行全基因扫描分析发现了1个中国人群的乳腺癌易感位点 rs2046210［4］，和Lianjie等通过对1 049例中国人群乳腺癌患者和1 073例健康对照者的乳腺癌易感基因FGFR2的多态性位点进行了关联分析，发现了2个乳腺癌易感位点rs1219648和rs2420946［5］。相对于国外此类研究，我国乳腺癌SNP易感位点研究较少。我们在前期北京汉族女性人群的GWAS研究中已获得了若干个P＜5.0×10-8的乳腺癌易感相关SNP位点，本研究为在黑龙江省女性人群中验证rs3006663，rs737495，rs6551328三个差异最显著位点，发现rs6551328基因型分布在病例对照组中差异具有统计学意义（P＜0.05），相对于CC基因型，CT杂合基因型的风险值OR＝1.776， 95%CI为1.155～2.728，提示该位点CT基因型可能是黑龙江地区汉族女性乳腺癌发病的风险因素。

研究现状表明，欲阐明乳腺癌发生发展的致病机理仍任重道远，未来欲了解乳腺癌的致病机理还将更多的依赖对乳腺癌低风险易感基因多态性及其相互作用的研究。

［1］Nasim Mavaddat，Antonis C．Antoniou，Douglas F．Easton，et al．Genetic susceptibility to breast cancer［J］． Molecular Oncology，2010，4（3）：174-191．

［2］吴桐，刘吉成． 乳腺癌易感基因研究现状［J］． 新乡医学院学报，2014，31（7）：579-582．

［3］Turnbull C，Ahmed S，Morrison J，et al． Genome-wide association study identifies five new breast cancer susceptibility loci［J］． Nat Genet， 2010，42（6）：504-507．

［4］Zhang W，Long JR，Gao YT，et al． Genome-wide association study identifies a new breast cancer susceptibility locus at 6q25．1［J］．Nat Genet，2009，41（3）：324-328．

［5］Liang J，Chen P，Hu Z，et al． Genetic variants in fibroblast growth factor receptor2 （FGFR2） contribute to susceptibility of breast cancer in Chinese women［J］． Carcinogenesis，2008，29（12）：2341-2346．

Association Study Between Positive SNP Polymorphism Loci of GWAS and Breast Cancer in Female of Heilongjiang Province

WU Tong1LIU Jicheng1QIU Yongqiang2LI Meiqian1HE Ning1LI Hongmei1LI Xichun31 Research Institute of Medicine & Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China，2 Public Health School，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China，3 The Third Affiliated Hospital，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China

ObjectiveTo analyze the correlation of three most significant loci polymorphism from preliminary GWAS results and the attack of Breast Cancerin female of Han group in Heilongjiang province．Methods150 breast cancer patients and 300 cases of age matched healthy controls without breast cancer were recruited from clinic． General clinical data and 5 ml peripheral venous blood from each cases were collected． Genomic DNA was extracted by kit． PCR/sequencing was used for genotyping． Allele frequency and genotype frequency was analyzed for comparison in both groups．ResultsThe genotype frequency distribution of each loci in case and control groups conformed to the Hardy-Weinberg genetic balance law． Statistical difference was not detected in allele frequency and genotype frequency of rs3006663 and rs737495（P＞0．05）． Genotype distribution of rs6551328 showed significant difference in both groups（P＜ 0．05）． Compared with CC genotype，the OR value of CT genotypes was 1．776， 95%CI was 1．155～ 2．728，suggested that CT genotypes might be the risk factor of breast cancer．Conclusionrs6551328 loci polymorphism associated with the attack of Breast Cancer in female of Han group in Heilongjiang province

Breast Cancer，Single nucleotide polymorphism， Susceptibility loci，Population distribution

R737．9

B

1674-9316（2015）27-0005-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．27．004

1 160006 齐齐哈尔医学院医药科学研究院；2 160006 齐齐哈尔医学院公共卫生学院；3 160006 齐齐哈尔医学院附属第三医院

黑龙江省科技厅攻关项目（编号：GC12C304-3）；黑龙江省教育厅资助项目（编号：12531829）；齐齐哈尔医学院“重大预研基金”项目