花叶矢竹叶绿体psbD基因的克隆与功能分析

许冰清，安苗苗，姜可以，徐丽丽，杨海芸，周明兵

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

花叶矢竹叶绿体psbD基因的克隆与功能分析

许冰清，安苗苗，姜可以，徐丽丽，杨海芸，周明兵

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

植物叶绿体光系统Ⅱ是植物进行光能转化、水的裂解和释放氧气的重要蛋白复合物，psbD基因编码光系统Ⅱ（PSⅡ）作用中心蛋白D2，D2和D1构成的异源二聚体上结合着与电子传递有关的大部分辅助因子和色素分子。以花叶矢竹Pseudosasa japonica f.akebonosuji为材料，提取总DNA，聚合酶链式反应 （PCR）扩增psbD基因全长序列（Pj-psbD）。序列分析表明：其开放阅读框（ORF）为1 059 bp，编码352个氨基酸，相对分子质量为39.59 kD，等电点为5.34，有6个跨膜结构，有别于高等植物中psbD蛋白普遍存在的5个跨膜区。psbD还具备有多个与光合作用有关的结构域和功能位点。本实验用荧光定量PCR技术检测了花叶矢竹叶片3个不同生长阶段和3种叶色中psbD基因的表达量。分析表明：在花叶矢竹叶片生长发育时期，为了满足叶片生长发育和叶绿体的形成的需要，psbD基因表达量逐步提高。研究还发现：psbD在白叶中的表达量显著高于绿叶，这可能与植物的光保护机制有关，降低强光对白色和部分白叶的光合系统的损伤。图8表1参25

分子生物学；花叶矢竹；psbD基因；克隆；叶色变异；荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）

高等植物中进行光合作用的4类复合物均分布于叶绿体类囊体膜中，它们分别是光系统Ⅱ（PSⅡ），细胞色素b6f复合物、光系统Ⅰ（PSⅠ）以及三磷酸腺苷酶（ATP合酶）［1］。光系统Ⅱ主要分布在垛叠的类囊体膜上，是一种包含P680反应中心的光合膜蛋白，由原初电子传递组分和20多种蛋白组成。光系统Ⅱ复合体主要由PSⅡ核心（主要包括D1，D2和细胞色素b559），核心天线蛋白（CP43和CP47），捕光天线复合体（LHCⅡ）和放氧复合体外周蛋白组成［2］。光系统Ⅱ中能进行光能转化、水的裂解和释放氧气，在光合作用过程中非常重要。psbA和psbD分别编码光系统Ⅱ反应中心蛋白D1和D2蛋白。D1和D2蛋白组成二聚体再与PSⅡ反应中心色素——叶绿素P680分子结合，共同构成光系统Ⅱ的光化学反应中心。其中的D2蛋白按照同步翻译-组装的模型插入类囊体膜［3-4］，并在类囊体膜上跨膜5次，最终形成N端在基质、C端在囊腔的跨膜蛋白［5］，D1蛋白以相同方式跨类囊体膜［5-6］。D1和D2蛋白在许多物种中都非常的保守,如高等植物、绿藻、眼虫和一些细菌［7］。由D1和D2构成两者组成的异源二聚体上结合着与电子传递有关的大部分辅助因子和色素分子，如原初电子供体P680，原初电子受体Pheoα，β-胡萝卜素，4个辅助Chla分子和1个非血红素铁。D1蛋白上的Tyr161（YZ）和D2蛋白上的Tyr161（YD）充当了电子传递载体。D1和D2蛋白的D-E连接段分别提供了质体醌QB和QA的结合位点，QA可能通过氢键结合着D2-His215，Ala261和Trp254［8］。D2蛋白代谢周转较慢，但在光抑制条件下速度加快［2］。D2不仅可以稳定膜上的光系统Ⅱ复合体，对D1蛋白的翻译及翻译后水平的调节也起到特殊的作用［9］。花叶矢竹Pseudosasa japonica f.akebonosuji原产于日本，是一种优良的珍稀观赏竹种，株高2 m左右，属于矮小型混生竹种，由矢竹Pseudosasa japonica自然变异而来，叶片颜色为绿白或白绿色条纹，竹丛优美，是重要的园林景观植物［10］。引种栽培至浙江农林大学翠竹园后，其叶片在生长发育过程中，产生叶色条纹变异，可呈现绿色、白色、绿白相间条纹。条纹的深浅、形状和出现个数和位置都不稳定，还会随着栽培条件的变化而变化［11］。经长期观察发现，来自同一叶芽的叶片，其叶色变化模式是一致的，即如果第1片展开叶为接近纯白叶，第2层、第3层以及最后1层叶片展开后叶色也接近纯白叶。psbD基因在叶绿体的进化过程中变化较小，高度保守［12］。本实验从花叶矢竹中克隆到psbD基因，对其序列进行了分析，并提取花叶矢竹总RNA，用反转录的cDNA为模板进行荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR），分析psbD基因在不同叶色、不同生长时期的表达情况，探讨了花叶矢竹叶色变异与光合系统psbD基因的关系。

1 材料和方法

1.1 植物材料和主要试剂

psbD基因克隆的实验材料为花叶矢竹（由日本引种栽培于浙江农林大学翠竹园）生长良好的幼嫩叶片。选取3种叶色类型，包括全绿叶（green，G），绿白相间条纹叶（green and albino，GA，1片叶子上绿和白各占约50%）和全白叶（albino，A）。每个类型的叶片各取了来自同一叶芽的3层叶片，即未暴露叶（S1），卷曲暴露叶（S2）和全展开叶（S3），总共有9个样品（图1），用于荧光定量PCR分析。

AT克隆pMD18-T Vector，Taq酶购自TaKaRa公司，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司的。转化用的大肠埃希菌Escherichia coli，DH5α由本实验室保存。RNeasy Mini Kit和RNase-Free DNase Set试剂盒购自QIAGEN公司。SYBR Premix Ex TapTMⅡ（Tli RNaseH Plus）和PrimeScriptTM Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒购至于TaKaRa公司。根据毛竹Phyllostachys edulis的 Actin基因设计引物，作为内参［13］，用于荧光定量PCR分析。PCR引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

图1 花叶矢竹Figure 1 Pseudosasa japonica f.akebonosuji samplings

1.2 方法

1.2.1 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取花叶矢竹总DNA 选取生长良好的花叶矢竹幼嫩叶片，用CTAB法［14］提取花叶矢竹总DNA，用于psbD基因的克隆。

1.2.2 PCR扩增psbD保守区域 根据已报道的psbD序列保守区域设计了1对引物（psbD-J-5，psbD-J-3，表1）。以花叶矢竹DNA为模板，PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液（无镁离子Mg2+）2.0 μL，氯化镁（25 mmol·L-1）1.2 μL，引物各 0.8 μL，TaKaRa Taq 0.1 μL，三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）1.6 μL，DNA模板1.0 μL，灭菌蒸馏水12.5 μL，总反应体积20.0 μL。反应程序为94℃预变性5 min；然后按下列循环参数进行扩增反应：94℃30 s，50℃30 s，72℃90 s，经35个循环后，72℃，10 min，以确保新生链延伸完全。PCR扩增产物经10 g·kg-1TAE琼脂糖凝胶电泳检验。采用上海生工生物工程公司胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，与PMD18-T载体连接，将PCR连接产物转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，37℃摇床振荡培养1 h后涂板［含氨苄西林（Amp）的Luria-Bertani培养基（LB）平板］，37℃培养12～16 h，直至出现单菌落，用枪头挑取单克隆至装有1.0 mL LB培养液（含Amp）的1.5 mL离心管中，37℃摇床振荡培养2～4 h。取1.0 μL菌液，用引物PsbD-J-5和PsbD-J-3验证，PCR反应程序为94℃预变性5 min；然后按下列循环参数进行扩增反应：94℃30 s，55℃30 s，72℃110 s，经35个循环后，72℃10 min。扩增产物经10.0 g·kg-1TAE琼脂糖凝胶电泳，将检测正确的阳性克隆菌液于-70℃保存，并送Invitrogen上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.3 PCR扩增psbD基因全长序列 将获取的psbD保守区域片段与已报道的竹子叶绿体基因组比对［15］，设计了1对引物（PsbD-F-5，PsbD-F-3，表1）。以花叶矢竹DNA为模板，PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液（无镁离子Mg2+）2.0 μL，氯化镁（25 mmol·L-1）1.2 μL，引物各 0.8 μL，TaKaRa Taq 0.1 μL，dNTP 1.6 μL，DNA模板 1.0 μL，灭菌蒸馏水12.5 μL，总反应体积20.0 μL。反应程序为94℃预变性5 min；然后按下列循环参数进行扩增反应：94℃30 s，44℃30 s，72℃80 s，经30个循环后，72℃10 min，以确保新生链延伸完全。PCR扩增产物经质量浓度为10.0 g·L-1TAE琼脂糖凝胶电泳检验。采用上海生工生物工程公司胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，与PMD18-T载体连接，将PCR连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性单克隆，用引物PsbD-F-5和PsbD-F-3进行PCR菌检，连接、转化与菌检过程同1.2.2。将检测正确的阳性克隆菌液于-70℃保存，并送上海英骏生物技术有限公司测序。

表1 PsbD的PCR的引物序列Table 1 PsbD PCR primers sequences

1.2.4 实时定量PCR分析 根据试剂盒说明书提取花叶矢竹各个样品的总RNA。所提取的总RNA的浓度采用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000测定，并用质量浓度为10.0 g·L-1的琼脂糖凝胶检测。根据所用反转录试剂盒说明书，10.0 μL的体系，将提取的RNA反转录成cDNA。包括2.0 μL的5×Prime-Script RT Master Mix（Perfect Real Time），总RNA的量最大到500 ng，最后用没有RNA酶污染的水（RNase Free dH2O）将总体系加到10.0 μL。轻柔混匀后进行反转录反应。反应条件如下：37℃15 min，85℃5 s，4℃。得到的cDNA用于下一步的RT-PCR反应的模板。其反应体系为10.0 μL体系，包括0.8 μL的反转录的cDNA，5.0 μL的2×SYBR Green I Mastermix，各0.4 μL的上下游引物（引物序列见表1，浓度为10.0 μmol·L-1），加双蒸水至反应总体积为10.0 μL，所有的样品均重复3次；反应条件：95℃预变性30 s，95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，共40个循环。RT-PCR使用的是CFX96TM Real-Time System仪器。

1.2.5 psbD基因全长序列分析 通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）ORF-finder（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）来鉴定序列的开放读码框（ORF）；核苷酸和氨基酸序列的同源性在 DNAStar，MAGE 5.0等软件完成；用Protparam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）和DNAStar分析氨基酸的相对分子质量和等电点等理化性质；通过blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#）获取蛋白序列的功能结构域信息；通过TMHMM（version2.0）（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析蛋白的跨膜区域。

2 结果

2.1 花叶矢竹总DNA的提取

采用CTAB法提取花叶矢竹总DNA，测得DNA样品光密度D（λ）为324.5 mg·L-1。将提取到的DNA作为模板，于-20℃冰箱保存，用于后续PCR扩增。

2.2 PCR扩增psbD保守区域

以花叶矢竹叶绿体DNA为模板，以psbD-J-5和psbD-J-3为引物，PCR扩增psbD保守区域，测序结果表明：克隆到的片段大小为1 046 bp。通过NCBI上Blast比对，结果表明：扩增片段为psbD 3′端部分序列，因此命名为psbD-P（图2）。

2.3 psbD基因全长的克隆

以花叶矢竹叶绿体DNA为模板，以psbD-J-5和psbD-J-3为引物进行PCR扩增，PCR产物用质量浓度为10 g·L-1TAE的琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后，在1 125 bp左右有亮带（图3），与预测的基因片段1 062 bp大小相符，初步确定为目的基因片段。测序结果表明，插入片段大小为1 062 bp（图4），包含完整的psbD序列，命名为Pj-PsbD。

图2 花叶矢竹psbD-P基因片段电泳检测图Figure 2 Electrophoresis of the amplification fragment of PjpsbD-P gene of Pseudosasa japonica f.akebonosuji

图3 花叶矢竹psbD基因电泳检测图Figure 3 Electrophoresis of the amplification fragment of PjpsbD gene of of Pseudosasa japonica f.akebonosuji

2.4 psbD基因和编码蛋白序列分析

用DNAStar软件和NCBI的Blast在线软件分析测序结果，该基因开放阅读框（ORF）的核酸序列及推导出的氨基酸序列如图4所示。结果表明：花叶矢竹psbD基因序列含有1个1 059 bp的开放阅读框（ORF），编码352个氨基酸。用Protparam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）进行基因序列编码的蛋白质分析预测。该蛋白氨基酸相对分子质量为39.59 kD，理论等电点为5.34，不稳定系数约为41.13。

图4 psbD编码区核酸序列及其推导出的氨基酸序列Figure 4 Nucleotide and predicted amino acid sequence of psbD

用TMHMM（version2.0）（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测蛋白的跨膜区域，跨膜结构预测结果显示出含有6个跨膜区（图5），这与高等植物中己经证实的5个跨膜区有差别［5-6］。

psbD氨基酸序列包含有6个蛋白接口，13个功能域，其中相关的功能域见图6。6个蛋白接口分别为：蛋白J接口，蛋白H接口，蛋白X接口，蛋白L接口，蛋白T接口，蛋白M接口。13个功能域分别是：D1界面，叶绿素结合位点，脱镁叶绿素结合位点，β-胡萝卜素的结合位点，细胞色素b559 β界面，醌结合位点，细胞色素b559 α界面，核心的捕光蛋白界面，CP43界面，铁离子结合的结合位点的，锰稳定多肽的界面，溴的结合位点和细胞色素c-550界面。

资料表明：由D1和D2构成两者组成的异源二聚体上结合着与电子传递有关的大部分辅助因子和色素分子，如原初电子供体P680，原初电子受体Pheoα，β-胡萝卜素，4个辅助Chla分子和1个非血红素铁。D1蛋白上的Tyr161（YZ）和D2蛋白上的Tyr161（YD）充当了电子传递载体。D1和D2蛋白的D-E连接段分别提供了质体醌QB和QA的结合位点，QA可能通过氢键结合着D2-His215，Ala261和Trp254［8］。

图5 psbD基因编码蛋白的跨膜区域Figure 5 psbD genes encoding amino acid sequence across the membrane area

用美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因数据库，对获得的PjpsbD基因序列进行了同源性分析，结果表明：Pj-psbD基因编码的蛋白与其他物种的psbD基因有着较高的相似性（图6），与玉米Zea mays中的Zm-psbD一致性达95%，与日本晴Oryza sativa subsp．japonica的OsJ-psbD一致性达98%，与籼稻O.sativa subsp.indica中的OsI-psbD一致性达98%，与大豆Glycine max中的Gm-psbD一致性达97%。

2.5 进化树分析

通过MAGE 5.0运用Neighbor-Joining方法构建不同物种间的系统进化树。对Pj-psbD基因编码的蛋白质进行系统进化树分析（图7），对比毛竹（YP004733564.1），水稻Oryza sativa（AAS46108.1），高粱Sorghum bicolor（YP899392.1），粟 Foxtail millet（AHV90309.1），二穗短柄草 Brachypodium distachyon（B3TNB8.1），玉米（NP 043009.1），花叶矢竹与毛竹中的psbD基因亲缘关系较近，其次和水稻的psbD基因。

2.6 psbD荧光定量PCR分析

图6 psbD基因编码蛋白的多序列比对Figure 6 Alignment analysis of amino acid sequences encoded by psbD

用质量分数为10.0 g·kg-1的琼脂糖凝胶检测提取的RNA结构完整，可以用于定量PCR分析。由熔解曲线来检验引物特异性，产物没有引物二聚体或其他非特异性扩增，该引物可用来检测基因表达量。用反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR，以Actin做为内参，psbD在花叶矢竹9个样品中的表达量如图8。结果显示：在全绿叶（G）中，psbD的表达量在全展开叶期（S3）最低，其次是卷曲暴露叶期（S2），表达量最高的是未暴露叶期（S1）；绿白相间条纹叶（GA）和全白叶（A）中psbD基因在S3期的表达量也是最低，S1和S2期的表达最高。对应的同一个发育阶段中，A叶片的表达量最高，G叶片表达量最低，即随着叶片绿色部分体积的减小，基因psbD的表达量逐渐上升。

图7 psbD基因编码蛋白系统进化树分析Figure 7 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequences encoded by psbD

3 讨论

用CTAB法提取植物叶片DNA，会得到叶片中所有的DNA，总DNA里包括叶绿体DNA，使用这种模板可以进行叶绿体和线粒体基因组上的扩增。所以，可以用CTAB法提取的植物叶片的DNA中扩增出psbD基因。叶绿体DNA（chloroplast DNA，cpDNA）属母性遗传，相对于核基因组，具有分子量小，结构简单，序列保守，突变率较低，遗传稳定等特点［16］。大多数高等植物的叶绿体基因组结构是稳定的，基因数量、排列顺序及组成上具有保守性［17］。psbD基因在叶绿体的进化过程中变化较小，高度保守。由psbD基因构建的进化树表明花叶矢竹与毛竹中的psbD基因亲缘关系较近，其次和水稻的psbD基因，但与玉米的亲缘关系较远。部分分子证据也表明，竹亚科 Bambusoideae和稻亚科 Ehrhartoideae有最近的亲缘性和最相似的基因序列结构［18-19］，在在早期的禾本科Gramineae分类中，水稻曾被分在竹亚科之下，与竹类植物分数不同的族［20］。

图8 psbD反转录RT-PCR在花叶矢竹不同组织不同时期的表达量Figure 8 Expression level of psbD in various organs of Pseudosasa japonica f.akebonosuji at different developmental stages

光照能促进叶绿体的形成。在个体发育中叶绿体由原质体发育而来，原质体存在于根和芽的分生组织中，由双层被膜包围，含有DNA、一些小泡和淀粉颗粒的结构，但不含片层结构，小泡是由质体双层膜的内膜内折形成的。在有光条件下原质体的小泡数目增加并相互融合形成片层，多个片层平行排列成行，在某些区域增殖，形成基粒，变成绿色原质体发育成叶绿体。在黑暗性长时，原质体小泡融合速度减慢，并转变为排列成网格的小管的三维晶格结构，称为原片层，这种质体称为黄色体。黄色体在有光的情况下原片层弥散形成类囊体，进一步发育出基粒，变为叶绿体。

PSⅡ复合体是叶绿体重要组成部分，其核心是由2个结构相似的D1和D2蛋白组成的光反应中心，D2蛋白在维持PSⅡ反应中心构像的稳定和电子传递方面起重要作用，同时还参与调节D1蛋白表达［21］。另一方面，有研究结果表明：从高等植物叶绿体中分离得到的PSⅡ反应中心D1对强光不稳定，其中色素分子以及组氨酸残基会发生光照破坏［22-24］，最终导致D1蛋白的降解。研究表明：D2蛋白上非原初电子受体pheo（反应中心复合物中去镁叶绿素a）对P680具有保护作用［25］。因此，叶绿体中的D2蛋白对PSⅡ的正常工作意义重大。

本实验用荧光定量PCR技术检测了花叶矢竹3种叶色3种不同生长阶段中psbD基因的表达量，得出成熟叶片（S3）中的表达量明显低于生长发育时期（S1，S2），而在不同叶色间比较，在全白叶中基因psbD表达量最高，在全绿叶（G）中的表达量最低，并且随着叶片白色部分的增多，psbD基因表达量逐渐上升。

花叶矢竹叶片处于S1和S2生长发育阶段时，叶面积变化最显著，叶片生长最快，为了满足叶片生长发育和叶绿体的形成的需要，psbD基因在3种类型的叶片S1和S2表达量最高，随着在叶片展开为成熟叶片以后，叶片生长变慢，表达量明显降低。在不同叶色间比较，在全白叶（A）中基因psbD表达量最高，这可能是不同叶色的叶片应对强光对光合系统的破坏的一种保护机制，因为在同等光照条件下，白叶透光率明显高于绿叶，白叶的光合系统更容易因光破坏而影响正常功能，D2蛋白上非原初电子受体pheo（反应中心复合物中去镁叶绿素a）对P680具有保护作用，因此，白叶中需要psbD高表达来降低光对白色和部分白叶的光合系统的损伤［24］，从而表现为在白叶中，psbD基因表达量最高。

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KUANG Tingyun,YU Zhenbao,TANG Chongqin,et al.Light-induced damage of histidine residues in photosystemⅡreaction center D1/D2/Cyt b559 complex［J］.Acta Biophys Sin,1993,35（3）：246-248.

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KUANG Tingyun,HOU Jianmin,PENG Dechuan,et al.Light-induced damage of pheophytin a molecule in the isolited PhotosystemⅡreaction center D1/D2/Cyt b559 complex［J］.Acta Biophys Sin,1995,37（5）：401-404.

Cloning and functional analysis of the psbD gene in Pseudosasa japonica f.akebonosuji

XU Bingqing,AN Miaomiao,JIANG Keyi,XU Lili,YANG Haiyun,ZHOU Mingbing
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

PhotosystemⅡ（PSⅡ）of a plant chloroplast is an important protein complex in light-dependent reactions of oxygenic photosynthesis with the psbD gene encoding the center protein D2.Until now,psbD gene in Pseudosasa japonica f.akebonosuji still would not been sequenced and reported.In order to analysis the psbD gene structure and the potential relation of psbD gene function and leaf color variation,in this study the genomic DNA of Pseudosasa japonica f.akebonosuji was extracted and the full-length psbD gene sequence（PjpsbD）was amplified by polymerase chain reaction（PCR）.The expression pattern for Pj-psbD was detected by the fluorescence quantitative PCR technique in three different growth （S1,S2and S3）stages using green,stripe and albino leavesof P.japonica f.akebonosuji leaves with three material replicates and three expriements replicates.Results showed that the Open Reading Frame （ORF）of Pj-psbD was 1 059 bp long encoding 352 amino acids with a relative molecular weight of 39.59 kD and an isoelectric point of 5.34.In the Pj-psbD polypeptide chain,there were six transmembrane domains,plus multiple photosynthesis domains and other function sites.Among the three colors of leaves the psbD expression level in the three growth stages of the albino leaves was highest with more than 2-4 times than those of the according three growth stages of the green leaves.The continuously increasing expression levels of the gene along with leaf growth and development forthe three types of leaves could meet the formation needs of the chloroplast,and the high psbD expression level in the albino leaf could be the protection mechanism that inhibits light damage in the photosynthetic system.［Ch,8 fig.1 tab.25 ref.］

molecular biology;Pseudosasa japonica f.akebonosuji;psbD genes;cloning;leave color variation; quantitative real time-polymerase chain reaction（qRT-PCR）

S795；Q786

A

2095-0756（2015）04-0557-09

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.04.010

2014-09-22；

2014-11-02

国家自然科学基金资助项目（31170565，31270645,31470615）；浙江省自然科学基金资助项目（LR12C16001,LY12C16002）

许冰清，从事竹类植物基因组进化研究。E-mail：349450241@qq.com。通信作者：周明兵，副教授，博士，从事竹类植物基因组进化研究。E-mail：zmbin@163.com