甜菜叶绿体分离及其 DNA提取

杨宝伟

(黑龙江省哈尔滨市呼兰区第四中学，哈尔滨 150500)

0 前言

自1880年，法国植物学家席姆佩尔发现植物叶绿体以来，人们对叶绿体的研究从未止步。自然界中植物通过叶绿体进行光合作用，而光合作用就是将二氧化碳和水转化为糖类，储存能量释放氧气。因此，光合作用几乎是植物生长不可或缺自然界不可或缺的过程。分子生物学的进步大大促进了植物叶绿体的研究水平。1960年人们发现叶绿体DNA(chloroplast DNA,cpDNA)。 它们是由具有光合作用的蓝细菌通过十亿年前的内分泌事件演化而来。叶绿体不仅能够进行光合作用，还参与完成了氨基酸、核苷酸、蛋白质等物质的代谢活动。其后，科研工作者1986年首次报道了烟草中叶绿体的全基因组序列。到目前为止已经完成了400种以上的植物叶绿体全基因组测序。开展植物叶绿体基因组分子生物学等方面的研究，前提就是分离出高质量的叶绿体。分离植物叶绿体常用的方法有3种：蔗糖密度梯度离心法、Percoll密度梯度离心法和高盐-低pH 法。本研究高盐-低pH 法探究甜菜叶绿体的分离提取方法，为深入了解甘薯叶绿体基因组、分析挖掘相关基因等研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料处理

以工大甜单1号为材料，材料种植于哈工大甜菜功能基因组实验室育苗中心，再4对真叶期，室温下暗处理3-4 d，充分消耗叶片中的淀粉多糖等，减少其对叶绿体分离的影响。

1.2 高盐-低pH法叶绿素提取

取甜菜叶片20-30 g加入缓冲液 A：1.25 mol/L NaCI，20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris-HCI(Ph 8.0)，0.25 mol/L Vc，1 mmol/L DTT,0.1% BSA。匀浆处理，低速匀浆3～5次，高速匀浆3～5次，每次6～10 s。匀浆结束后，先用8层纱布过滤匀浆液，将滤液收集完整，分装到50 mL离心管中，4℃条件下1 000 r/min离心4 min，将上清转移到新的50 mL离心管中，弃沉淀，该步骤重复1次;将上清液液转移到新的50 mL离心管中，4 000 r/min离心15 min，收集沉淀弃上清液；用25 ml预冷的缓冲液B:20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，0.1% BSA，1.25 mol/L NaCI，1 mmol/L DTT)轻轻重悬沉淀，4 000 r/min离心15 min，收集沉淀，弃上清液，重复1次该步骤；用25 mL缓冲液 C:7 mmol/L EDTA-Na2，40 mmol/L蔗糖，50 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，0.1% BSA)再重悬沉淀。4 000 r/min离心15 min，收集沉淀，弃上清液；再用2 ml 缓冲液C重悬沉淀，同时加入 DNaseI(8～10 μL)和10 μL 的2 mmol/L MgCI2，37℃水浴锅孵育30 min，期间摇晃混匀8～10 次，加 入1.7 mL 的 EDTA-Na2(500 mmol/L)，终止该酶解反应，室温静置8～10 min；加入 40 mL 缓冲液D ：1.25 mmol/L NaCI，50 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)。50 mmol/L NaF。混匀以后2 000 r/min离心20 min，收集沉淀弃上清液，用2 mL缓冲液E:100 mmol/L NaCI，50 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，1 mmol/L DTT重悬沉淀，得到完整的叶绿体溶液。

1.3 叶绿体 DNA的提取

叶绿体溶液中加入 0.5 ml 20%SDS 溶液破碎叶绿体，加入10 μL蛋白酶K(10 mg/ml)去除蛋白质，55℃水浴3 h；加入0.5 mL 5 mol/L KAc冰浴20 min．加入等体积的饱和酚抽，10 000 r/min离心10 min；收集上清液加入0.5 mL CTAB/NaCI溶液和0.5 mL体积比为24∶1的氯仿/异戊醇并充分混匀，以10 000 r/min离心10 min；在上清液中加入0.05 mL的3 mol/L NaAc和1 mL的无水乙醇，置于-20℃环境中过夜。以10 000 r/min离心 20 min后，弃置上清液，收集沉淀物，用70%酒精漂洗2次，自然凉干．沉淀加入100～500 μL 无菌水，得到cpDNA 溶液。

1.4 叶绿体DNA检测

使用NanoDrop 2000微量分光光度计测定叶绿体 DNA 溶液的浓度与纯度。

2 结果与分析

2.1 叶绿体分离结果比较

通过分析表明，高盐-低pH 法操作简单，利用普通离心机多次离心即可满足分离要求，且叶绿体产率较高，叶片中叶绿体约为 7.344×107个/g。在目镜10倍和物镜40倍的显微镜下可观察到清晰完整的叶绿体。

2.2 叶绿体DNA检测

用微量紫外分光光度计检测叶绿体 DNA 纯度与浓度，高盐-低pH 法的 A260/A280比值为1.86，介于1.80和2.00之间,质量浓度分别为 80.1 ng/μL，高盐-低 pH 法分离 得到的叶绿体DNA 产率较高，鲜质量分数为269 ng/g。

3 讨论

本研究结果表明，使用高盐-低pH 法均能够分离得到质量较好的甜菜叶片的叶绿体，高盐-低pH法相较传统方法具有操作简单，耗时短且产率高等优点。并可用于后续的叶绿体 DNA、蛋白质提取分离工作等。在传统纯化 DNA 过程中会在缓冲液中加入抗氧化剂，如β巯基乙醇等，但是其具有刺激性气味，毒性较大。而本研究所使用 DTT作为抗氧化剂，不仅刺激气味小，毒性也小低。在裂解叶绿体之前，使用 DNaseI消化核基因组 DNA，能够有效地降低了核基因组的污染。在分离甜菜叶片叶绿体之前，暗处理3-4 d，可有效地降低叶片中糖分对叶绿体分离的影响，而且在提取叶绿体DNA 时，加入 CTAB/NaCI可以去除多糖的污染。