胰岛素对人肝癌HepG2细胞的侵袭特性及增殖能力的影响

胰岛素对人肝癌HepG2细胞的侵袭特性及增殖能力的影响

刘晓梅郑辉陈尚吴萍萍1

(苏州卫生职业技术学院护理学院，江苏苏州215009)

摘要〔〕目的探讨不同浓度胰岛素对肝癌细胞系HepG2侵袭特性及体外增殖能力的影响及其可能机制。方法将人肝癌细胞系HepG2细胞培养于不同胰岛素浓度的高糖培养基中，应用预铺Matrigel基质胶的Transwell小室检测不同胰岛素浓度对HepG2细胞侵袭能力的影响；应用PI单染流式细胞仪技术检测不同浓度胰岛素对HepG2细胞周期的影响；运用CCK-8方法检测不同浓度胰岛素对HepG2细胞增殖能力的影响；同时应用RT-PCR检测不同胰岛素浓度培养的HepG2细胞中MMP-2、、MMP-9转录水平的变化。结果在一定浓度范围内，HepG2细胞的侵袭能力与胰岛素浓度成正相关(P<0.05)；在一定浓度范围内，高浓度胰岛素能促进HepG2细胞的体外增殖能力，并加快HepG2细胞G0/G1至S期转换，加快细胞周期的进展(P<0.05)；在一定浓度范围内，HepG2细胞MMP-2、MMP-9转录水平与胰岛素浓度成正相关(P<0.05)。结论在一定浓度范围内，胰岛素可能通过上调基质金属蛋白酶表达水平促进HepG2的侵袭能力，并通过驱动HepG2细胞G0/G1至S期转换促进HepG2细胞的增殖能力。

关键词〔〕HepG2细胞；高胰岛素；侵袭；基质金属蛋白酶；增殖

中图分类号〔〕R446.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：江苏省卫生厅卫生职业技术教育研究立项课题(No.JZ201101)

1苏州卫生职业技术学院生物技术中心

第一作者：刘晓梅(1972-)，女，教授，硕士，主要从事高职基础医学教学研究。

2010年美国糖尿病学会(ADA)和美国癌症学会(ACS)联合发表共识声明指出糖尿病(主要为2型)与包括肝癌在内的多种恶性肿瘤的发生风险增加有关，相关数据分析显示，糖尿病患者原发性肝癌发生的相对风险约为一般人群的2倍以上〔1〕。一般认为糖尿病可通过数种机制来影响肿瘤的发生发展，如胰岛素/胰岛素样生长因子受体轴、高胰岛素血症、高血糖或慢性炎症等〔2〕。在2型糖尿病中普遍存在高胰岛素血症被认为与肿瘤的发病密切相关，但其确切机制尚不清楚〔3〕。本研究探讨高糖环境中不同浓度的胰岛素对肝癌细胞系HepG2侵袭特性及增殖能力的影响及其可能机制。

1材料与方法

1.1材料及仪器肝癌细胞HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，8 μm Transwell板购自美国corning公司，Matrigel基质胶购于美国BD公司，总mRNA提取Trizol试剂盒购自南京生兴生物公司，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，PCR引物合成于苏州金唯智技术有限公司，CCK-8试剂购自日本同仁株式会，细胞周期试剂盒购自南京凯基生物公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，DMEM高糖细胞培养基购自美国Gibco公司，GENMED结晶紫细胞染色试剂购自上海杰美医药科技有限公司，胰岛素购自江苏万邦生化医药公司。

1.2实验分组阴性对照组：常规培养，无胰岛素干预；胰岛素干预组分为1×10-8mmol/L胰岛素组、1×10-6mmol/L胰岛素组、1×10-4mmol/L胰岛素组。

1.3细胞侵袭实验将HepG2细胞培养至对数生长期，常规消化计数，重悬于不同胰岛素浓度的无血清高糖DMEM中，并调整浓度至2×105个/ml，取150 μl细胞悬液接种到预铺有Matrigel基质胶的Transwell小室中，Transwell小室外面加入600 μl含10%胎牛血清的完全培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养。48 h后，用棉签轻轻擦除小室上层的细胞，并参照说明书用GENMED结晶紫细胞染色试剂盒将Transwell小室下层细胞着色，每孔随机选取10个视野拍照并计数分析，分析细胞侵袭能力的变化。实验重复3次。

1.4细胞增殖实验培养HepG2细胞至对数生长期，常规消化计数，调整细胞浓度至2×104个/ml,然后将细胞接种于96孔板中，每孔100 μl细胞悬液，置于细胞培养箱中培养，细胞每天更换不同胰岛素浓度的新培养基。每板设4组细胞，每组5个重复孔，共铺6个板。自第一天起，每天用CCK-8检测细胞增殖情况。在避光条件下每孔加10 μl CCK-8溶液，继续置于培养箱中孵育90 min。然后用酶标仪在450 nm波长处测定其光吸收值，共6 d，作出生长曲线。实验重复3次。

1.5细胞DNA分布在6孔板中培养各组细胞密度至70%～80%，常规制备单细胞悬液，收集至离心管中，用预冷的PBS洗涤细胞两次。预冷的1 ml PBS再次重悬细胞，逐滴加入3 ml预冷的无水乙醇，4℃固定过夜后去除上清，并用预冷PBS洗涤细胞两次。然后加入100 μl Rnase A 37℃水浴30 min。再加入400 μl PI染色混匀，4℃避光孵育30 min。用流式细胞仪在488 nm波长处检测，分析各组细胞DNA分布。重复3次。

1.6逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测与侵袭迁移相关的基因转录水平的变化按照总mRNA Trizol提取试剂盒与逆转录试剂盒操作说明提取细胞总mRNA，并将4 μg mRNA逆转录为cDNA。取1 μl cDNA进行20 μl体系PCR扩增，电泳结果用Quentity One软件进行拍照分析。PCR引物如下：MMP-2上游引物,5’-AGGCAAGTGACTTCTCAGTTTCT-3’，下游引物,5’-TATCCATCGCCATGCTCCCA-3’；MMP-9上游引物，5’-TTCAGGGAGACGCCCATTTC-3’，下游引物，5’-TGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3’；GAPDH上游引物,5’-ATGGGCAGCCGTTAGGAAAG-3’，下游引物,5’-GCAAATGAGCCCCAGCCTTC-3’。

1.7统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1不同浓度胰岛素在体外对HepG2细胞侵袭能力的影响在侵袭实验中，无胰岛素组、1×10-8mmol/L胰岛素组、1×10-6mmol/L胰岛素组、1×10-4mmol/L胰岛素组穿过Transwell小室基膜的细胞数分别为(35.3±2.9)、(39.7±3.5)、(53.7±3.2)及(81.7±2.9)，各组间穿膜细胞数差异有统计学意义(P<0.05)。表明胰岛素能显著促进HepG2细胞侵袭和迁移能力，并在一定浓度范围内呈剂量依赖性。见图1。

2.2不同浓度胰岛素在体外对HepG2细胞增殖能力的影响随着胰岛素浓度的增加，HepG2细胞的增殖能力逐渐增加，且在1×10-4mmol/L时胰岛素的促增殖作用异常显著，各浓度组间的差别有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1　倒置显微镜白光下所拍穿过Transwell小室基底膜 各组细胞的情况(×100)

图2　各组细胞的增殖曲线

图3　各组细胞细胞周期分析图

2.3不同浓度胰岛素在体外对HepG2细胞细胞周期分布的影响随着胰岛素浓度的增加，处于S期的细胞比例逐渐增加，处于G1期的细胞比例逐渐减少，胰岛素干预组较无胰岛素干预组差异有统计学意义(P<0.05)。见图3和表1。这说明胰岛素可加快HepG2细胞G0/G1至S期转换，促进HepG2细胞周期进展。

表1　不同浓度胰岛素对HepG2细胞周期分布的影响 ± s)

与无胰岛素干预组比较：1)P<0.05

2.4不同浓度胰岛素在体外对HepG2细胞中金属基质蛋白酶(MMP)-2、MMP-9转录水平的影响随着胰岛素浓度的升高，HepG2细胞中MMP-2、MMP-9转录水平逐渐升高，各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

M：marker，A：无胰岛素干预，B：1×10 -8 mol/L，C：1×10 -6 mol/L，D：1×10 -4 mol/L 图4　RT-PCR检测不同浓度胰岛素干预后HepG2 细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平变化

3讨论

越来越多的证据显示糖尿病是肝癌发生发展过程中独立风险因素和术后复发的重要预后指标，糖尿病与原发性肝癌之间存在密切的关系〔4,5〕。2型糖尿病以胰岛素抵抗为主要特征，胰岛素抵抗致使胰岛素分泌代偿性增加，胰岛素是一种多功能激素类蛋白质，也是人体细胞重要的生长因子，体外实验、动物实验和流行病学研究表明，高浓度胰岛素能通过多种途径促进癌症的发生发展〔3,6〕，但其具体机制尚不明确。

肿瘤细胞快速、不可控性增殖是其癌变特性的最直接表现，肿瘤细胞的这种生物学特性决定了其较正常组织代谢旺盛，尤以恶性肿瘤更为明显，为了满足肿瘤细胞的迅速生长和分裂需要，其物质代谢发生了一系列特征性改变。而胰岛素作为细胞代谢中不可或缺的调控因子，其与癌细胞生长的关系一直备受关注〔7,8〕。本实验结果提示，胰岛素可通过加快HepG2细胞周期进程、促进细胞的分裂从而促进其增殖能力。

侵袭性生长是恶性肝癌细胞最显著的临床病理学特点之一，也是其肝癌患者术后复发及转移的重要原因。本试验表明，高浓度胰岛素可能是肝癌恶化的重要原因。侵袭是一个多因素参与的、多步骤的高度协调过程，主要涉及以下三个步骤：肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)的黏附、肿瘤细胞分泌蛋白水解酶水解ECM以及细胞迁移出基底膜。其中ECM的降解被认为是整个侵袭行为的关键步骤〔9〕。MMPs是存在于肝癌细胞中重要的蛋白水解酶，能够有效降解ECM，大量报道表明，MMPs在恶性肝癌中过度表达，且其表达水平与肝癌的恶性程度密切相关〔10〕。本实验结果表明，高浓度胰岛素可能是通过增加MMP-2、MMP-9转录活性而促进肝癌细胞侵袭能力。

4参考文献

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5卢瑜.糖尿病与恶性肿瘤关系的回顾性临床研究〔J〕.中华内分泌代谢杂志,2010;3(26):183-7.

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9Von Deiming A,Fimmers R,Schmidt MC,etal.Comprehensive allelotype and genetic anaysis of 466 human nervous system tumors〔J〕.J Neuropathol Experim Neurol,2000;59(6):544-58.

10Ha TY,Hwang S,Moon KM,etal.Sorafenib inhibits migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells through suppression of matrix metalloproteinase expression〔J〕.Anticancer Res,2015;35(4):1967-76.

〔2014-06-19修回〕

(编辑苑云杰)