四种医院制剂微生物限度检查法验证试验

杨 静 李晓翠 徐轶飞

北京军区联勤部药品仪器检验所，北京 100071

四种医院制剂均为含多种成分的复方制剂，处方组成比较复杂，其中呋柳擦剂与复方土荆皮酊处方中均含有水杨酸、苯甲酸成分，具有抗表皮真菌、止痒作用，用于手癣、脚癣、体癣等各种皮肤癣症。由处方和功效可知，这两种制剂具有一定的抑菌作用，含抑菌成分的医院制剂的微生物限度检查，必须先消除供试液的抑菌活性，然后再根据中国药典规定的方法进行检查［1-3］。复方大承气口服液是由大黄、芒硝、赤芍、桃仁、莱菔子、厚朴丝等药材组成，具有化瘀行气、通里攻下的作用，用于治疗各型肠梗阻。防风解毒口服液主要由白芷、防风、荆芥、紫苏叶、桂枝、桔梗等药材经加工而成，具有发散风寒、辛温解表的作用。医院制剂没有规定具体的微生物限度检查方法，根据国家药典委员会的要求，按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法，分别对四种医院制剂进行了方法的验证，为规范医院制剂的微生物限度检查方法，提供了科学的依据。通过验证，复方大承气口服液、防风解毒口服液可用常规法进行微生物限度检查。呋柳擦剂与复方土荆皮酊细菌计数采用薄膜过滤法检查，霉菌和酵母菌计数采用常规法检查。

1 资料与方法

1.1 仪器

HTY-2000集菌仪（杭州泰林医疗器械厂）；GH-6000隔水式培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；LRH-250-MS霉菌培养箱（韶关泰宏医疗器械有限公司）；DF3-3红外线高温干燥箱（北京兴争仪器设备厂）；LDZX立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.2 菌种

大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、金黄色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）［CMCC（B）26003］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］均购于中国药品生物制品检定所。

1.3 培养基及试药

营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、改良马丁、改良马丁琼脂、胆盐乳糖、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号分别为131218、1312192、131016、1309122、120113、140110、140124）均购自中国药品生物制品检定所。

1.4 样品

呋柳擦剂（北京军区北戴河疗养院，批号：20120917）、复方大承气口服液（解放军第261医院，批号：121022）、复方土荆皮酊（解放军白求恩国际和平医院，批号：20120524）、防风解毒口服液（解放军第261医院，批号：121105）。

2 方法

按照《中国药典》2010年版一部［4］附录XⅢ C微生物限度检查法进行验证试验。

2.1 菌液的制备

（1）取经37℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物1mL，用0.9％无菌氯化钠溶液10倍稀释制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。

（2）取经25～28℃培养18～24h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1mL，用0.9％无菌氯化钠溶液10倍稀释制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。

（3）取经25～28℃培养5～7d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加入3～5mL 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液，用0.9％无菌氯化钠溶液10倍稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。

2.2 供试液的制备

分别取供试品lOmL，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，制成1∶10的供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母茵计数方法的验证

试验组（1）常规法：取1∶10的供试液1mL和50～100cfu试验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。各试验菌株的回收率结果，见表l。（2）培养基稀释法：分别取1∶10的供试液0.5、0.2mL和50～100cfu试验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。（3）薄膜过滤法：取1∶10的供试液10mL加入薄膜过滤器中，全量通过薄膜后，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，冲洗量为100mL/膜，在冲洗液中加入50～100cfu试验菌，滤干，将滤膜贴至营养琼脂培养基平板上，培养观察结果。菌液组：除不加供试液外，其余操作同试验组。供试品对照组：除不加试验菌外，其余操作同试验组。

稀释剂对照组∶用稀释液代替供试液，其余操作同试验组。

3 结果

3.1 常规法

从表1的回收率试验结果可以看出：采用常规法，复方大承气口服液和防风解毒口服液对5种试验菌株的回收率均＞70％，无明显抗菌活性，细菌、霉菌及酵母菌计数均可用常规法检查；复方土荆皮酊对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和白色念珠菌的回收率均＜70％，有明显的抑菌作用；呋柳擦剂对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的回收率均＜70％，对枯草芽胞杆菌的回收率为0，说明有显著的抑菌作用。结果见表1。

表1 常规法的回收率试验结果（％）

表2 培养基稀释法的回收率试验结果（％）

3.2 培养基稀释法

从表2的回收率试验结果可以看出：采用培养基稀释法后，复方土荆皮酊对对枯草芽胞杆菌的回收率＜70％；呋柳擦剂对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的回收率均＜70％，因此，采用培养基稀释法，复方土荆皮酊和呋柳擦剂仍有较强的抑菌活性。见表2。

3.3 薄膜过滤法

从表3的回收率试验结果可以看出：采用薄膜过滤法后，复方土荆皮酊和呋柳擦剂对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的回收率均＞70％，消除了抑菌活性，细菌计数均可用薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数采用常规法检查。见表3。

表3 薄膜过滤法的回收率试验结果（％）

4 讨论

医院制剂疗效确切，价格低廉，深受群众欢迎，因此，质量控制尤其是微生物限度检查显得尤为重要［5-8］，只有建立科学的检查方法，完善、提高医院制剂的质量标准评价体系，才能有效提高医院制剂的监管水平。

呋柳擦剂和复方土荆皮酊的处方中均含有水杨酸和苯甲酸，这两种成分对微生物的生长有一定的抑制性，药品中污染的微生物在这些成分的影响下有可能检不出，但是当抑菌成分消除后或浓度降低时，这些微生物便可复苏并繁殖，如果按照常规法进行检查，可能会造成检验结果的漏检或者误判［9-16］。因此分别采用培养基稀释法、常规法和薄膜过滤法逐一进行了验证，来降低或消除抑菌成分对试验的干扰，以证明所采用的方法适合于该药物微生物限度检查。试验中发现，在制备呋柳擦剂和复方土荆皮酊的供试液时，由于处方中均含有水杨酸和苯甲酸，加入稀释液后易产生絮状沉淀，因此应充分摇匀保证试验的平行性和有效性。在稀释菌液时采用了旋涡混悬器进行混匀，这种方法本研究在以往的文献中尚未查到，是在反复的试验、思考中摸索而来，此法耗时短，方法简单，不需用吸管反复吹打，降低了劳动强度，提高了工作效率。

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