胃癌中Notch1、DLL4和HES1的表达及其与临床病理特征和预后的关系

·论著·

胃癌中Notch1、DLL4和HES1的表达及其与临床病理特征和预后的关系

何黎黎张富花张锦华庄剑波张建刚韩俭

摘要：目的通过检测Notch信号系统中的Notch1、DLL4和HES1蛋白在胃癌组织中的表达，分析它们与患者临床病理特征及生存期之间的关系，探索胃癌发生发展的机制。方法 将胃癌、癌旁组织制作组织芯片，采用免疫组化法检测Notch1、DLL4和HES1的表达，随访患者，分析它们的表达与患者临床病理特征及生存期之间的关系。结果Notch1在胃癌、癌旁及对照组中的表达阳性率分别为48.30%、25.00%和16.67%，三者间差异有统计学意义(P<0.05)；Notch1的表达阳性率在有淋巴结转移组中为41.3%，显著低于无淋巴结转移组(61.28%，P<0.05)；在其他病理特征间Notch1表达差异均无统计学意义(P>0.05)。DLL4在胃癌、癌旁和对照组中的表达阳性率分别为55.94%、45.7%和56.67%，三者间差异无统计学意义(P>0.05)；在不同病理特征间DLL4的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。HES1在胃癌、癌旁和对照组中的表达阳性率分别为36.64%、34.40%和33.3%，三者间差异无统计学意义(P>0.05)；HES1在低分化胃癌中的表达阳性率为51.43%，高于高/中分化组(31.25%，P<0.05)；在其他病理特征间HES1的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。Notch1、DLL4和HES1阳性组和阴性组生存期之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论胃癌组织中Notch1呈高表达，可作为胃癌诊断和治疗的靶点；Notch1的表达与胃癌淋巴结转移呈负相关；HES1在低分化胃癌中表达升高，可能是胃癌分化程度的一个标志物。

关键词：胃癌；Notch1；DLL4；HES1；临床病理特征；生存期

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2015.02.018

基金项目：甘肃省科技支撑计划(1011FKCA120)

收稿日期：(2014-07-20)

作者单位：730000兰州大学病原生物学研究所，甘肃省新药临床前研究重点实验室(何黎黎，韩俭)；730000甘肃兰州，甘肃省第二人民医院消化科(张富花，张锦华，庄剑波)；730000兰州大学病理学研究所(张建刚)

通信作者：韩俭，Email: hanj@lzu.edu.cn

Relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancerHELi-li,HANJian.DepartmentofPathogenicBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,KeyLabofPreclinicalStudyofNewDrugsofGansuProvince,LanzhouUniversity,Lanzhou(730000),China.ZHANGFu-hua,ZHANGJin-hua,ZHUANGJian-bo.DepartmentofGastroenterology,SecondPeople′sHospitalofGansuProvince,Lanzhou(730000),China.ZHANGJian-gang.DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou(730000),China

Abstract：ObjectiveThis paper detected Notch signaling components--Notch1, DLL4 and HES1 expression in the gastric cancer and follow-up patients survival in order to analyze their relationship with clinicopathological characteristics and survival, and to explore the mechanism of gastric cancer development. MethodsGastric cancer and paracancerous tissue cases were used to manufacture tissue microarray. Immunohistochemistry was used to detect Notch1, DLL4 and HES1 expression. Patients′ survival time were followed up. The relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and clinicopathological characteristics, and survival of patients were analyzed. ResultsThe Notch1 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 48.30%, 25.00% and 16.67%, and the expression of gastric cancer group was significantly higher than that of other groups (P<0.05). The positive rate in the gastric cancer with lymph node metastasis group (41.3%) was significantly lower than that without lymph node metastasis group (61.28%) (P<0.05). The DLL4 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 55.94%, 45.7% and 56.67% respectively, there was no significant difference between different groups (P>0.05). The HES1 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 36.64%, 34.40% and 33.3%, and there was no significant difference between different groups (P>0.05). The HES1 positive rate (51.43%) in poorly differentiated gastric cancer was significantly higher than that in the high/middle differentiation group (P<0.05). There was no relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and the patients′ survival time (P>0.05). ConclusionsGastric cancer tissues showed high expression of Notch1 which can be used as a target for gastric cancer diagnosis and treatment. Notch1 expression was negatively correlated with lymph node metastasis. HES1 expression increased in poorly differentiated gastric cancer, which may be act as an indicator of the degree of differentiation.

Key words：Gastric cancer; Notch1; DLL4; HES1; Clinicopathologic characteristic; Survival

胃癌是全球常见和高致死率的恶性肿瘤之一，2011年大约有738 000人死于胃癌[1]。胃癌的形成是多因素作用的结果。正常机体胃黏膜上皮细胞的增殖与凋亡之间的动态平衡依赖于体内多种细胞信号转导途径的精细调节，一旦平衡被破坏，细胞正常的增殖、凋亡等生物学行为会发生紊乱，导致细胞异常增生、分化，甚至发生肿瘤。在肿瘤发展过程中，细胞信号转导途径参与改变细胞黏附性、基质降解、新生血管和淋巴管形成以及逃逸机体免疫等多个环节，共同协助肿瘤持续增殖、浸润及转移。

Notch信号通路是干细胞形成信号网络中非常重要的一步，对细胞的分化、增殖和凋亡具有广泛的调控作用，与肿瘤发生发展有密切关系[2]。研究发现，Notch信号通路的配体DLL4在调控血管的萌发和分支形态中扮演着重要的角色[3]。Notch信号的下游基因HES1与成骨肉瘤细胞的转移能力有关[4]。本研究通过应用组织芯片，检测Notch 信号通路中Notch1、DLL4和HES1蛋白在胃癌、癌旁及淋巴结中的表达情况，分析其表达与患者病理特征的关系以及对患者生存期和预后的影响，有助于进一步探讨胃癌发生发展的分子机制。

1资料与方法

1.1　 研究对象

本研究选取1999年至2004年甘肃武威肿瘤医院的胃癌患者的术后石蜡标本，共192例胃癌组织及56例癌旁组织 (取材距癌组织边缘>60 mm)。所有患者均有详细的临床资料和手术纪录，术前均未行化学治疗、放射治疗。胃癌患者中男15l例、女41例，年龄30～73岁，中位年龄55岁。病变局限于黏膜和肌层内5l例(其中黏膜层8例)，浸及浆膜或浆膜外141例；有淋巴结转移116例，无淋巴结转移76例；低分化癌99例，中分化癌45例，高分化癌48例；肠型96例，弥漫型84例，混合型12例。取30例当地同期胃镜检查无癌变患者的胃黏膜作对照。所有标本均征得患者同意及医院伦理委员会批准。

1.2　试剂

SP-9000及DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Notch1、DLL4、HES1多克隆抗体(香港Abcam，按说明书稀释，稀释度分别为：Notch1 1∶200，DLL4 1∶50，HES1 1∶100)。用已知阳性片作为阳性对照(由所购试剂公司提供)，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3　方法

1.3.1组织芯片制备制作空白模具蜡块，打出6×7个间距为1 mm、直径为2 mm的孔。标本常规苏木精-伊红(HE)染色，镜下观察选取1个代表性位点，采集直径为2 mm的组织芯放入模具蜡块相应孔内，左上角两孔用鼠组织定位。石蜡包埋，制成组织芯片。

1.3.2免疫组化染色依照试剂说明书，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法对Notch1、DLL4和HES1进行染色检测。凡染色过程中掉片者被淘汰。

1.3.3结果判断参照Masunaga等[5]的方法，对Notch1、DLL4和HES1染色结果进行半定量评分：根据组织细胞的染色范围，阳性细胞数<5%、5%～25%、26%～50%、>50%以上分别计为0、1、2、3分； 根据阳性细胞的染色强度，按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别判定为-、+/-、+、++，即0、1、2、3分。最后依据两项计分之和来综合判断，≥3分者为阳性，≤2分者为阴性。

1.4　随访及统计学分析

采用电话、上门询问等方法对192例患者进行随访，有111 例获得随访，随访时间为术后6～79个月。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料用成组设计t检验，并进行Spearman等级相关分析，计数资料采用χ2检验，生存分析用Kaplan-Meier曲线，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1　 Notch1、DLL4和HES1在不同组织中的表达情况

组织芯片经过免疫组化染色后，可见Notch1主要在细胞质表达，少数在细胞核表达，呈淡黄色或棕黄色或棕褐色(见图1a)。Notch1在胃癌、癌旁及对照组中的表达阳性率分别为48.30%、25.00%和16.67%，胃癌组阳性率显著高于癌旁组织及对照组，三者间差异有统计学意义(P<0.05)，其中胃癌组显著高于癌旁组(P<0.05)和对照组(P<0.05)。见表1。

表1　Notch1在不同病理组织中的表达情况

注：与癌旁组织和对照组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP>0.05

正常组织中，DLL4主要在细胞膜表达，在异型增生和癌组织中则表达在细胞质(见图1b)。DLL4在胃癌、癌旁组织和对照组中的表达阳性率分别为55.94%(80/143)、45.7%(16/35)和56.67%(17/13)，三者间差异无统计学意义(χ2=1.263，P=0.532)。

HES1主要在细胞质和细胞核中表达，呈淡黄色或棕黄色或棕褐色(见图1c)。HES1在胃癌、癌旁组织和对照组中的表达阳性率分别为36.64%(48/131)、34.40%(11/32)和33.3%(10/30)，三者间差异无统计学意义(χ2=0.148，P=0.929)。

注：1aNotch1；1bDLL4；1cHES1；1d阴性对照

图 1Notch1、DLL4和HES1在胃癌组织中的表达

(免疫组化染色，×400)

2.2　Notch1、DLL4和HES1共表达结果分析

Notch1和DLL4共同阳性率为15.09%，两者无相关性(r=-0.036，P=0.584)。Notch1和HES1共同阳性率为12.21%，两者无相关性(r=-0.052，P=0.450)。DLL4和HES1共同阳性率为15.57%，两者无相关性(r=0.000，P=0.996)。Notch1、DLL4和HES1共同阳性率为4.72%，三者无相关性(r=-0.014，P=0.901)。

2.3　Notch1、DLL4和HES1的表达与临床病理特征的关系

有淋巴结转移组中Notch1表达阳性率(41.3%)显著低于无淋巴结转移组(61.28%，χ2=5.797，P=0.016)。在其他不同病理特征组比较中，Notch1阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。不同胃癌病理特征之间DLL4表达的差异无统计学意义(P>0.05)。肠型胃癌的DLL4阳性率(50.63%)与弥漫型胃癌(35.95%)比较，有升高的趋势(P=0.056)。HES1在低分化胃癌组织中阳性率(51.43%)显著高于高/中分化组(31.25%)(χ2=4.499，P=0.029)。在其他不同临床病理特征组比较中，HES1阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4　Notch1、DLL4和HES1的表达与生存期分析

应用Kaplan-Meier生存分析，结果显示随访到的111例患者的半数生存期为(34.21±2.78)个月(2～79个月)。Notch1阳性组和阴性组的平均生存期分别为(49.41±6.55)个月和(44.07±6.01)个月，差异无统计学意义(P>0.05)；DLL4阳性组和阴性组的平均生存期分别为(39.78±5.17)个月和(56.86±7.20)个月，差异无统计学意义(P>0.05)；HES1阳性组和阴性组的平均生存期分别为(35.00±7.37)个月和(49.80±5.54)个月，差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

Notch信号通路由跨膜的受体、配体、核内结合蛋白及靶基因4部分组成，在胚胎正常发育、细胞分化、肿瘤的发生发展等生理病理过程中起着重要的作用[6-7]。目前发现的哺育动物Notch受体包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4 四种，为单链跨膜蛋白，具有细胞表面受体和核内转录调控双重功能。Notch信号的配体在果蝇中称Delta和Serrate，哺乳动物中与Delta同源的配体称为Delta样分子(DLL)，与Serrate同源的配体称为Jagged，共包括5种配体分子，即DLL1、DLL3、DLL4、Jagged-1 和Jagged-2。Notch信号配体与受体的DSL结构域结合，经过γ-分泌酶介导的蛋白酶酶切后，Notch受体的活化形式NICD被释放入细胞质中，并易位入细胞核与转录因子结合，发挥对靶基因的调控作用。Notch信号影响的靶基因主要包括含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域的HES和HRT家族[8]。

研究证实，Notch信号通路与多种实体肿瘤如肺腺癌、前列腺癌等的发生发展有关[9-11]。4种Notch受体成员中，Notch1是在肿瘤组织中最常被检测到的[12]。关于Notch在胃癌组织中的表达情况，目前研究报道有差异，大多数研究支持在胃癌组织表面Notch1的表达升高[13]，亦有研究报道降低[14]。本研究发现，Notch1在胃癌组织中的表达阳性率显著高于癌旁组织和对照组，提示Notch1在胃癌的发生发展中具有重要的作用，但与患者的生存期无相关性，Notch1可作为胃癌诊断和治疗的靶点。本研究还显示，Notch1在有淋巴结转移组表达阳性率下降，其机制需要进一步探讨。研究表明，Notch1受体活化后与胃癌进展的关系与环氧合酶-2(COX-2)相关。Notch1受体活化后的细胞内片段N1IC可促进细胞集落形成能力和人胃腺癌SC-M1细胞移植瘤生长。N1IC和C启动子结合因子1(CBF1)结合后，与COX-2启动子连接，通过依赖CBF1的途径促进COX-2在SC-M1细胞株中的表达。COX-2通过前列腺素E2与相邻细胞的细胞膜EP受体结合，经G2蛋白偶联途径或过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)促进胃癌生长[15]。另外，Notch1可通过直接作用于核因子-κB(NF-κB)下游的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和/或caspase-3下游的靶基因而发挥抑制凋亡作用[16]。

DLL是Notch信号的重要配体，主要包括DLL1、DLL3和DLL4，均为跨膜糖蛋白，N端富含有半胱氨酸的DSL基序，可以与Notch结合而活化Notch信号[17]。血管的形成在肿瘤的生长和转移过程中起主要的作用。DLL4在人类多种肿瘤血管组织中过表达，且DLL4的高表达受血管内皮生长因子(VEGF)的正向调节[18]。本研究发现，DLL4在胃癌、癌旁组织和对照组细胞表面的表达，以及DLL4阳性/阴性表达的患者的病理特征、生存期之间差异均无统计学意义。关于DLL4表达与胃癌的关系仍需进一步探讨。

HES是Notch信号系统的下游靶基因，属于bHLH基因家族[8]，表达广泛。HES1参与细胞的分化，可使多种不成熟细胞维持在未分化状态，可能在多种肿瘤的发生中起到癌基因的作用[19]。Notch信号活化后，酶切产生的NICD 进入核内，激活下游靶基因HES1，HES1通过负性调节抑癌的磷酸酶和张力蛋白(PTEN)基因，活化磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，从而促进肿瘤增殖、浸润和侵袭[20]。本研究结果显示，HES1在胃癌、癌旁组织和对照组细胞表面的表达，以及HES1阳性/阴性表达的患者生存期之间差异均未见显著性差异。但是HES1表达与胃癌的分化程度密切相关，在低分化胃癌组织中表达上调，提示HES1可作为反映胃癌分化程度的重要标志物。

Notch1、DLL4和HES1的表达与胃癌患者的生存期之间无相关性，提示Notch信号系统不是胃癌独立的预后因素。

参考文献

1Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011, 61: 69-90.

2Katoh M, Katoh M. Notch signaling in gastrointestinal tract. Int J Oncol, 2007, 30: 247-51.

3Gale NW, Dominguez MG, Noguera I, et al. Haploin-sufficiency of delta-like 4 ligand results in embryonic lethality due to major defects in arterial and vascular development. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101: 15949-15954.

4Dailey DD, Anfinsen KP, Pfaff LE, et al. HES1, a target of Notch signaling, is elevated in canine osteosarcoma, but reduced in the most aggressive tumors. BMC Vet Res, 2013, 9: 130.

5Masunaga R, Kohno H, Dhar DK, et al. Cyclooxygenase-2 expression correlates with tumor neovascularization and prognosis in human colorectal carcinoma patients. Clin Cancer Res, 2000, 6: 4064-4068.

6Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science, 1999, 284: 770-776.

7Ehebauer M, Hayward P, Arias AM. Notch, a universal arbiter of cell fate decisions. Science, 2006, 314: 1414-1415.

8Karsan A. The role of notch in modeling and maintaining the vasculature. Can J Physiol Pharmacol, 2005, 83: 14-23.

9Chen Y, De Marco MA, Graziani I, et al. Oxygen concen-tration determines the biological effects of NOTCH-1 signaling in adenocarcinoma of the lung. Cancer Res, 2007, 67: 7954-7959.

10Fan X, Khaki L, Zhu TS, et al. NOTCH pathway blockade depletes CD133-positive glioblastoma cells and inhibits growth of tumor neurospheres and xenografts. Stem Cells, 2010, 28: 5-16.

11Leong KG, Gao WQ. The Notch pathway in prostate development and cancer. Differentiation, 2008, 76: 699-716.

12Reedijk M. Notch signaling and breast cancer. Adv Exp Med Biol, 2012, 727: 241-257.

13李大卫, 吴晴, 彭志海, 等. Notch1和PTEN在胃癌组织中的表达及其意义. 癌症, 2007, 26: 1183-1187.

14周梅恺, 赵娜, 叶玉伟, 等. Notch1, Jagged1和COX-2蛋白在胃癌中的表达及相关性研究. 中国肿瘤临床, 2012, 39: 1082-1086.

15Yeh TS, Wu CW, Hsu KW, et al. The activated Notch1 signal pathway is associated with gastric cancer progression through cyclooxygenase-2. Cancer Res, 2009, 69: 5039-5048.

16Yao J, Qian C. Over-activated Notch-1 protects gastric carcinoma BGC-823 cells from TNFalpha-induced apoptosis. Dig Liv Dis, 2009, 41: 867-874.

17Katoh M, Katoh M. Notch signaling in gastrointestinal tract. Int J Oncol, 2007, 30: 247-251.

18Williams CK, Li JL, Murga M, et al. Up-regulation of the Notch ligand Delta-like 4 inhibits VEGF-induced endothelial cell function. Blood, 2006, 107: 931-939.

19Palomero T, Sulis ML, Cortina M, et al. Mutational loss of PTEN induces resistance to NOTCH1 inhibition in T-cell leukemia. Nat Med, 2007, 13: 1203-1210.

20Ranganathan P, Weaver KL, Capobianco AJ. Notch signalling in solid tumours: a little bit of everything but not all the time. Nat Rev Cancer, 2011, 11: 338-351.

(本文编辑：林磊)