对凝血酶诱导血小板活化分子机制的研究

孙海燕 毛德奎 董俏言 于爱平★

（1.威海卫人民医院 山东 威海 264200；2.中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850）

血小板是血液中的重要成分，其在保持血管的完整性及防止血管损伤后出血等方面均发挥重要的作用。血小板是人体防御出血的重要机制，此防御机制与血小板的活化聚集密切相关。但是，血小板过度的活化聚集又会导致血栓形成，甚至会引发急性心肌梗死、脑卒中和 不稳定型心绞痛等血栓栓塞性疾病[1-3]。PI3K/Akt信号通路是血小板活化过程中的重要信号转导途径[4]。PI3K通路的活化可导致细胞周期蛋白（Cyclin）等蛋白表达水平的上调，促进G1期的进展，从而加速细胞代谢的周期，促进细胞的增殖和分化。PTEN蛋白是PI3K/AKT信号通路的负调控因子，PTEN蛋白可抑制PI3K/AKT信号通路的激活。PTEN/ PI3K/Akt的信号通路已被证实在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用，然而该通路在凝血酶诱导血小板活化的过程中是否具有相应的作用还有待于进行深入的研究。为了进一步探讨凝血酶诱导血小板活化分子的机制，为研发阻断血小板活化的抗血小板聚集类药物提供理论依据，笔者对36例健康人的血液标本的实验资料进行回顾性研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次研究的对象为36例健康人的血液标本。这36例健康人均符合以下情况：①其在进行实验前的2周内均未服用过药物。②其均无吸烟史。在这36例健康人中，有男性20例，女性16例。他们的年龄在20岁～29岁之间。

1.2 实验方法

1.2.1 实验试剂 本次研究所使用的抗体均购自Cell Signaling Technology公司，Thrombin（凝血酶）、Apyrase（ATP酶抑制剂）均购自 sigma公司，PGE1（前列腺素E1）购自Cayman Chemical公司，BCA法蛋白定量试剂盒购自Thermo公司。

1.2.2 制备血小板的方法 按照静脉采血指南中的操作方法，用浓度为3.8%（w/v） 的枸橼酸钠抗凝管采集研究对象肘部的静脉血液作为标本。将血液标本轻微混匀，以1000 rpm的转速对血液标本进行15 min的离心处理后，吸取上层血浆，即得到PRP（富血小板血浆）。向PRP中加入终浓度为5 mM的EDTA（乙二胺四乙酸）、0.1μg/mL的PGE1、1 U/mL 的Apyrase溶液，静置20min。然后，以2000rpm的转速对此溶液进行10min的离心处理后即获得血小板沉淀液，弃上清液。将制取的血小板重悬于HEPES-Tyrode（台氏液）缓冲液中，将血小板的终浓度调整为106/μL。

1.2.3 对凝血酶进行处理的方法 将0.5U/mL的Thrombin与血小板 在 37℃ 的恒温培养箱中用不同的时间共同孵育，或配置不同浓度的Thrombin与血小板在37℃的恒温培养箱中共同孵育8h。将共同孵育后的实验样本加入细胞裂解液，进行冰浴30 min后，以12000 rpm的转速在4℃下进行15 min的离心处理，取上清液测量其蛋白质的浓度后备用。另取不做任何处理的血小板作为空白对照标本。

1.2.4 进行 Western blot 实验的方法 将蛋白样品经SDSPAGE凝胶电泳后，转印至PVDF膜上。使用目的蛋白（Akt、p-Akt、PTEN、p21、p27和skp2）一抗分别与PVDF膜共同孵育。在孵育结束后，用HRP标记的相应二抗处理杂交一抗的PVDF膜，最后在暗室 对PVDF膜进行显影。将GAPDH作为内参蛋白，样品中目的蛋白的相对含量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

1.3 统计学处理 我们使用SPSS16.0软件包对本次实验中的数据进行处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 凝血酶激活血小板P I3K/Akt信号通路的结果Akt蛋白是PI3K的下游效应蛋白，Akt磷酸化是PI3K通路被激活的标志。本次研究主要通过检测Akt磷酸化的水平来判断PI3K/Akt的信号通路是否被激活。结 果显示，凝血酶能够激活血小板的PI3K/Akt的信号通路（如图2-1所示）。在加入凝血酶后能够显著上调血小板中p-Akt蛋白的表达水平。随着凝血酶作用时间的延长，血小板中p-Akt蛋白的表达水平明显上调，且具有时间依赖效应。 在进行凝血酶处理的20min后，血小板中p-Akt蛋白的表达水平最高。随着凝血酶处理时间的进一步延长，血小板中Akt磷酸化的水平并没有显著升高。另外，在使用不同浓度的凝血酶对血小板进行处理的8h后，血小板中p-Akt蛋白的表达水平明显上调，此效应在一定范围内具有浓度依赖效应（如图2-2所示）。在凝血酶的浓度达到4U/mL时，血小板中p-Akt蛋白的表达水平最高。

图2-1 凝血酶与血小板中的AKT磷酸化水平的时效关系

图2-2 凝血酶与血小板中的AKT磷酸化水平的量效关系

2.2 凝血酶抑制PTEN蛋白表达的结果 PTEN蛋白是PI3K/AKT信号通路的负调控因子。为了明确凝血酶对PI3K/Akt信号通路的活化机制，我们进一步测定了PTEN蛋白的表达情况（如图2-3和图2-4所示）。与空白对照血小板标本相比，实验标本在加入凝血酶后，血小板中PTEN蛋白的表达水平显著下调，且具有时间和浓度的依赖效应。

图2-3 凝血酶与血小板中PTEN表达的时效关系

图2-4 凝血酶与血小板中PTEN表达的量效关系

2.3 凝血酶抑制周期蛋白p21蛋白和p27蛋白表达的结果 通过检测凝血酶对PI3K/Akt信号通路的下游分子--细胞周期调控蛋白p21和p27蛋白的表达水平，可以判断出凝血酶对PI3K/Akt信号通路的影响。本次研究结果显示，凝血酶可显著下调血小板中p21和p27蛋白的表达水平，且其抑制效果会随着时间和凝血酶浓度的增加而加强（如图2-5至2-8所示）。

图2-5 凝血酶与血小板中p21表达的时效关系

图2-6 凝血酶与血小板中p21表达的量效关系

图2-7 凝血酶与血小板中p27表达的时效关系

图2-8 凝血酶与血小板中p27表达的量效关系

3 讨论

血小板是由成熟的巨 核细胞裂解产生的人体含量最多的无核细胞[5]。血小板在止血、消炎和伤口愈合的过程中均发挥着重要的作用。凝血酶作为血小板活化的主要配体之一，在血栓的发生和发展中具有重要的作用。但是，凝血酶在激活血小板表面相应的蛋白酶活化受体后，血小板内还有哪些细胞内分子或信号通路参与该活化作用尚未得到完全的证实。PI3K可以被多种炎症趋化因子、细菌毒素及血管活性激动剂激活，在炎症、癌症及心血管疾病的发生、发展的过程中发挥重要的作用[6-8]。有研究发现，PI3K通路是调节血压及血栓形成的重要转录途径，PI3K通路主要是通过激活其下游效应蛋白Akt的磷酸化而发挥作用。经凝血酶活化前后，血小板内关键蛋白的表达水平会发生变化，活化后的血小板内的Akt在丝氨酸473位点发生磷酸化，使PI3K/Akt的信号通路被激活。细胞周期蛋白p21 和p27主要通过对细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的抑制作用来阻断G1期到S期的转换，实现对细胞周期的负调控。细胞S期激酶相关蛋白2（Skp2）是SCF 泛素连接酶复合体的特异底物识别亚单位F-box蛋白家族的成员之一，此蛋白可特异性地作用于细胞周期蛋白[9]，使其通过泛素-蛋白质酶体的途径降解，从而调控G1期向S期的转换。

综上所述，凝血酶可通过激活血小板内的PTEN/PI3K/Akt的信号通路而发挥作用，并可通过调控血小板内细胞周期蛋白的表达诱导血小板的活化。

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