正交设计结合响应曲面法研究白芥子中芥子碱的提取工艺

陈恩慧，秦　钰，李蕴哲，廖予菲，赵新锋*

(1.西北大学生命科学学院中药学系，西安　710069；2.陕西国际商贸学院医药学院，西安　710086)



正交设计结合响应曲面法研究白芥子中芥子碱的提取工艺

陈恩慧1，秦钰1，李蕴哲1，廖予菲2，赵新锋1*

(1.西北大学生命科学学院中药学系，西安710069；2.陕西国际商贸学院医药学院，西安710086)

摘要：目的建立测定白芥子中芥子碱含量的高灵敏质谱方法，进一步优化并获得药材中芥子碱的最佳提取工艺。方法高效液相色谱-电喷雾-串联质谱法测定芥子药材中芥子碱的含量，以芥子碱含量为指标，以热醇回流为提取方法，采用正交设计和响应曲面2种方法优化白芥子药材中芥子碱的提取工艺。结果芥子碱质量浓度在15.5～294.5 μg·mL-1范围内提取离子峰峰面积与浓度呈良好的线性关系，方法检测限为0.1 ng·mL-1，白芥子中芥子碱的最佳提取工艺为：40倍量体积分数为65%的乙醇，60 ℃加热回流提取5.0 h。结论高效液相色谱-串联质谱法具有特异性强的特点，可作为白芥子中芥子碱的含量测定方法；正交设计结合响应曲面法能准确确定白芥子中芥子碱的最佳提取工艺，能为其他中药提取工艺的优化提供借鉴。

关键词：白芥子；芥子碱；高效液相色谱；质谱；正交设计；响应曲面法

白芥子为十字花科(Cruciferae)1～2年生草本植物白芥Brassicaalba(L.) Bois.的干燥成熟种子，在止咳、平喘和化痰方面具有独特的疗效[1-2]。芥子碱为季铵盐类生物碱，已被广泛作为白芥子药材质量控制研究的重要指标[3]。文献检索发现，芥子碱的含量测定方法主要包括高效液相色谱法[4-6]、毛细管电泳法[7]和电化学方法[8]。然而，作为芥子碱含量测定的主要方法，高效液相色谱法依然存在分析时间长和灵敏度低(0.1 mg·L-1)的问题[9-10]。本论文建立了基于高效液相色谱-离子阱多级质谱反应模式的白芥子中芥子碱的含量测定方法，并用该方法结合正交设计及响应曲面法对芥子碱的提取工艺进行了优化，以期为复杂样品中芥子碱的高灵敏快速分析及其制备提供方法学借鉴。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1100系列高效液相色谱-离子阱质谱联用系统(美国安捷伦公司)；BS224S型万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)；TGL-16G高速离心机(上海安宁科学仪器公司)。

1.2试药白芥子药材购于西安市万寿路药材市场，经西北大学生命科学学院房敏峰教授鉴定为十字花科植物白芥Brassicaalba(L.) Boi的干燥成熟种子；芥子碱硫氰酸盐对照品(中国药品生物制品检定所，批号171241-201006)；色谱纯乙腈(美国Fisher公司)；其他试剂除特别说明外均为分析纯。

2方法与结果

2.1样品制备

2.1.1对照品溶液的配制准确称取芥子碱硫氰酸盐对照品粉末12.5 mg，置于5.0 mL量瓶中，加5.0 mol·L-1甲酸水溶液充分溶解并定容至刻度，4 ℃冷藏，备用。

2.1.2药材供试品溶液的制备称取白芥子药材10.0 g，60 ℃烘箱干燥至恒质量，粉碎，过40目筛。取5.0 g药材粉末包裹于脱脂棉中，放入索氏提取装置，石油醚加热脱脂12 h后，转移至表面皿中挥干石油醚。准确称取脱脂后药材粉末1.0 g，加入30.0 mL体积分数为65%的乙醇溶液，冷浸20 min，加热回流提取1 h，减压蒸干，加5.0 mol·L-1的甲酸水溶液定容至50.0 mL，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，4 ℃冷藏备用，进样前稀释1 000倍。

2.2分析条件

2.2.1色谱条件色谱柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流速：0.8 mL·min-1，检测波长：326 nm；流动相：5.0 mol·L-1甲酸水-乙腈(30︰70)；进样体积：5.0 μL；柱温：25 ℃。

2.2.2质谱条件电喷雾正离子模式电离；雾化气压力：35 psi；干燥气流速：8.0 L·min-1；干燥气温度：350 ℃；毛细管电压：4 500 V；质量扫描范围m/z：100～500。拟定色谱条件下，芥子碱对照品溶液和白芥子药材供试品溶液色谱图见图1。

图1提取离子流图

A. 对照品；B. 供试品

Fig.1 Extract ion chromatograms

A. reference standard；B. sample

3结果与讨论

3.1方法学考察

3.1.1线性范围精密吸取芥子碱对照品溶液10，0，70，100，130，160和190 μL，用5.0 mol·L-14的甲酸水溶液定容至1.0 mL量瓶中，配制成质量浓度分别为15.5，62.0，108.5，155.0，201.5，248.0和294.5 mg·mL-1的芥子碱标准溶液。拟定色谱条件下，准确吸取5.0 μL，进样以m/z310.3→251.2为选择离子对，采用多级反应模式进行峰面积的测定，以提取离子峰峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行回归，得回归方程：Y=0.000 2X+0.049 1，r=0.999，表明芥子碱质量浓度在15.5～294.5 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.1.2精密度精密吸取白芥子药材供试品液5.0 μL，连续进样5次，测得芥子碱硫氰酸盐质量浓度依次为403.6，405.7，401.2，404.2和404.8 μg·mL-1。求得相对标准偏差RSD为0.4%。结果表明，该方法具有较好的精密度。

3.1.3稳定性取白芥子药材供试品液5份，在0，1，2，4和6 h后，分别进样5.0 μL，测得芥子碱质量浓度依次为407.9，402.6，404.8，406.6和405.1 μg·mL-1。求得RSD为0.5%。结果表明，芥子碱在拟定条件下可稳定存在6 h。

3.1.4重复性平行称取白芥子药材粉末5份，按药材供试品溶液制备方法制备样品，分别进样5.0 μL，测得芥子碱质量浓度分别为406.9，401.0，403.2，405.6和402.1 μg·mL-1。计算RSD为0.6%。结果表明，该方法重复性良好。

3.1.5回收率平行称取5份经脱脂处理的白芥子药材，分别加入质量浓度为1.0 mg·mL-1的芥子碱对照品溶液0.1 mL，按照2.1.2项下方法制备白芥子药材供试品溶液。进样5.0 μL，测得芥子碱质量浓度分别为812.3，804.2，805.7，810.2和803.6 μg·mL-1，进一步计算芥子碱的平均回收率为98.5%。结果表明，该方法具有较好的回收率。

3.2提取工艺优化

3.2.1正交设计设定乙醇体积分数、料液比、回流时间和温度4项为考察因素，体积分数分别为A1(35%)，A2(65%)，A3(95%)；料液比分别为B1(1∶20)，B2(1∶30)，B3(1∶40)；回流时间分别为C1(4.0 h)，C2(4.5 h)，C3(5.0 h)；温度D1(60 ℃)，D2(80 ℃)，D3(100 ℃)。结果见表1。

由表3可见：回流时间和温度对芥子碱得率无显著性影响，而乙醇体积分数及料液比对芥子碱得率影响显著。各因素对芥子碱提取率影响大小顺序为A>B>D>C。在所有因素中，醇体积分数对芥子碱得率影响最大。芥子碱的最佳提取工艺组合为A2B3C3D1。该结果说明，白芥子药材中芥子碱的最佳提取工艺为：40倍量体积分数为65%的乙醇，60 ℃下热回流5 h。

表1热醇回流法正交实验结果

Tab.1 Experimental results of orthogonal design for extracting sinapine by reflux with heat ethanol

序号ABCD质量浓度/μg·mL-111111486.021222552.331333586.942123524.052231635.262312599.173132369.783213426.293321489.4Ij1.631.381.511.61IIj1.761.611.571.52G=4.67IIIj1.291.681.591.54CT=2.42Ij/30.540.460.500.54IIj/30.590.530.520.51IIIj/30.430.560.530.51Sj0.040.020.000.00方差来源偏差平方和自由度 均差F显著性A0.0420.0226.12*B0.0220.0110.68*C0.0020.000.74D0.0020.001.00

注：F0.01(2，2)=99；F0.05(2，2)=19.0；F0.1(2，2)=9.0；*为显著，**为极显著

3.2.2响应曲面法参考正交设计分析结果，选定α(乙醇体积分数)、β(料液比)和t(温度)3个因素，以δ(芥子碱浓度)为响应值，采用响应曲面法优化白芥子药材中介子碱的提取工艺(图2)，提取方案及结果见表2。

图2三维响应曲面图

A.乙醇体积分数与料液比；B.乙醇体积分数与温度；C.温度与料液比

Fig.1 Three dimensional response curves

A.ethanol volume fraction and material ratio；B.ethanol volume fraction and temperature；C. temperature and material ratio

表2芥子碱提取响应面法实验结果

Tab.2 Results of the extraction of sinapine by response surface methodology

序号乙醇体积分数/%料液比/mL·g-1温度/℃芥子碱质量浓度/μg·mL-11352060466.02952060369.13354060586.94954060429.45353040561.96953040493.77353080559.88953080426.29652040561.610654040569.111652080524.112654080612.113653060631.214653060635.615653060634.416653060633.317653060629.1

采用多参数拟合法对表4数据进行分析，得回归方程：γ=0.63-0.057α+0.035β-8.013×10-3t-0.015αβ-0.016αt+0.02βt-0.11α2-0.057β2-9.222×10-3t2。应用Design Expert软件得到该回归模型进行方差分析，得P<0.000 1，R2=0.982 4，一次项α、β及二次项α2、β2对提取率的影响均达到极显著水平，其余各项均显著，说明响应回归模型具有较高的显著水平和良好的拟合度。

3.2.3白芥子最佳提取工艺验证精密称取3份经石油醚脱脂处理的白芥子药材，每份0.2 g，按照最佳提取工艺进行处理，获得供试品溶液，在拟定分析条件下，测得芥子碱的质量浓度分别为698.3，697.6和695.2 μg·mL-1。计算RSD为1.0 %。

4小结

本论文以芥子碱硫氰酸盐为指标，以m/z310.3→251.2为选择离子对，建立了白芥子药材中指标成分芥子碱含量测定的高效液相色谱-离子阱质谱方法。与传统液相色谱方法相比[11]，该方法由于采用了基于选择离子对的多级反应检测模式，不仅能有效排除药材中共存物质的干扰，而且显著提高了分析速度和检测灵敏度，具有特异性强和分析速度快的特点，有望为白芥子复方及其生物样品等复杂体系中芥子碱的高灵敏快速测定提供方法学借鉴。

响应曲面法是目前进行待测指标提取工艺优化研究的经典方法之一[12-13]。该方法以回归方程作为函数估算的主要依据，能以多项式函数的形式描述各因子和响应值之间的相互影响，并进行优化。因此，该模型已经发展成为药学和化学工程领域优化加工工艺参数和反应条件的有效数学方法之一。本文在经典正交设计研究结果的基础上，以芥子碱硫氰酸盐为指标，采用响应曲面法对白芥子中芥子碱的提取工艺进行了优化，证明该方法可用于优化中药有效成分提取过程中的各影响因素水平及交互作用。与经典的均匀设计及正交设计相比，该方法由于考虑了各因素水平间的交互作用，在稳定性和工作量方面具有简易、科学和合理的特点，为准确快速地确定中药复杂样品中目标成分的提取工艺提供了方法。

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Study on the extraction procedure of sinapine in white mustard seed by orthogonal design and response surface methodology

CHEN Enhui1，QIN Yu1，LI Yunzhe1，LIAO Yufei2，ZHAO Xinfeng1*(1.Department of Traditional Chinese Medicine，College of Life Science， Northwest University，Xi′an 710069， China；2.Medicinal School，Shaanxi Institute of International Trade and Commerce，Xi′an 710086，China)

Abstract:ObjectiveTo develop a high sensitive method for the determination of sinapine in white mustard seed and to optimize the extraction procedure of sinapine. MethodsThe content of sinapine in white mustard seed was determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Then the concentration of sinapine was used as an index to optimize the ethanol extraction procedure of sinapine from white mustard seed by orthogonal design and response surface methodology. ResultsThe area of extracting peak of sinapine was linearly corresponded to its concentrations in the range of 15.5-294.5 μg·mL-1.The detection limit of the method was 0.1 ng·mL-1. The optimized conditions were confirmed to be 5 h of heating reflux by forty folds of 65% ethanol at 60 ℃. ConclusionHigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry has the advantages of high specificity. This property enables it to become the preferable method for measuring sinapine in white mustard seed. The combination of orthogonal design with response surface methodology is capable of establishing the optimized extracting procedure of sinapine in white mustard seed.

Key words:White mustard seed；sinapine；HPLC；mass spectrometry； orthogonal design；response surface methodology

收稿日期：(2015-06-18)

通信作者：*赵新锋，男，副教授

作者简介：陈恩慧，女，在读本科生

基金项目：国家自然科学 (编号：21475103， J1210063)；教育部长江学者和创新团队发展计划(编号：IRT1174)；陕西省重点科技创新团队计划(编号：2013KCT-24)；陕西省自然科学基金(编号：2015JM2072)。

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0008-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.003