绿竹甲酸预处理脱木素的响应面法优化

唐兴平　刘　婧　罗小林　黄六莲　陈礼辉

(福建农林大学材料工程学院,福建福州,350002)



研究论文

绿竹甲酸预处理脱木素的响应面法优化

唐兴平刘婧罗小林*黄六莲陈礼辉

(福建农林大学材料工程学院,福建福州,350002)

摘要：利用Design-Expert统计软件对影响绿竹甲酸预处理过程中木素溶出率的4个自变量(甲酸含量、液比、最高温度和保温时间)进行四因素五水平的中心复合设计,建立全因素二项式方程(模型Ⅰ)。以参数的显著性为判定依据,对全因素二项式方程进行简化处理,得到模型Ⅱ。将这2个模型用于木素溶出率预测，尽管2个模型的变异系数相近,且预测值与实测值的相关系数均高于0.9,但模型Ⅱ的信噪比比模型Ⅰ高近20%,表明简化模型不仅可较好地预测绿竹甲酸预处理过程中的木素溶出率,且稳定性较高。木素溶出率与固体基质中纤维素酶水解转化率之间为指数关系；但随木素溶出率的增加,纤维素溶出率也随之增加,最终酶水解葡萄糖得率呈先升高后降低的变化趋势；为获得更多的葡萄糖,较优的木素溶出率约为50%。

关键词：甲酸预处理；响应面法优化；木素溶出率；纤维素酶水解；葡萄糖得率

为缓解化石能源有限储量及其利用引起的环境问题,开发可再生清洁能源(如纤维素燃料乙醇等)已成为重要的研究课题[1]。然而,木质生物质的结构非常致密,纤维素、半纤维素和木素通过共价键连接形成的异质性高分子聚合物结构严重影响纤维素酶水解生产可发酵葡萄糖的效率[2]。为了提高木质生物质中纤维素对酶的可及性,预处理已成为纤维素燃料乙醇生产过程中必不可少的过程[3]。

现有的预处理方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法预处理主要包括研磨和盘磨处理等,这些预处理过程较为清洁,但设备投资和能耗相对较高[4]。化学法预处理主要包括热水预处理、酸预处理、碱预处理、蒸汽爆破、有机溶剂预处理等[5- 8]。化学预处理中热水预处理最清洁,但对木质生物质中纤维素酶水解转化率的提高不明显[5]。稀酸(如稀硫酸和稀盐酸)预处理可使半纤维素发生酸性水解而溶于预处理液中,固体基质中纤维素酶水解转化率得以显著提高,但无机酸难以回收,且对设备的腐蚀性比有机酸强[9]。酸性亚硫酸盐是化学预处理中效率较高的预处理方法,但大量硫化物(如二氧化硫、亚硫酸盐和亚硫酸氢盐等)残留于预处理液和固体基质中,不仅对操作人员的人身安全造成危害和对大气产生不可忽视的影响,同时也对糖化和发酵过程使用的酶和微生物具有一定的毒害作用[10]。稀碱预处理对设备的腐蚀性相对较低,但固体基质中残留的碱以及木素的碱性降解产物会抑制酶的水解效率,将这些物质洗出需耗用大量的洁净水[11]。尽管有机溶剂(如乙醇等)预处理所用溶剂易于回收,但需添加无机酸或碱来提高预处理效率,最终也存在常规无机酸和碱法预处理所存在的问题[12]。典型的生物法预处理为白腐菌预处理,处理条件温和,对设备和能耗的要求较低,基本无污染物产生,但处理周期过长,半纤维素和木素去除率低,预处理后固体基质中纤维素酶水解效率也较低[13]。

综上所述,现有预处理方法均无法同时满足显著提高纤维素酶水解效率、能耗低、环保、预处理液对人体无毒无害且易于回收等要求。相对而言,尽管有机酸预处理对设备也有一定的腐蚀性,但该方法所需能耗较低,预处理液易于回收,且可显著提高木质生物质中纤维素酶水解效率。因此,本实验采用有机酸(如甲酸)对我国丰富的非木材资源(绿竹)进行预处理；利用Design-Expert统计软件对甲酸预处理实验方案进行中心复合设计；同时考察甲酸预处理木素溶出量对固体基质中纤维素酶水解转化率和葡萄糖得率的影响,以期为以非木材资源为原料的纤维素燃料乙醇生产的产业化提供理论基础。

1实验

1.1原料与药品

实验用原料为福建漳州某林场提供的3年生绿竹,经切片、磨粉至过40～60目筛和风干后备用。糠醛(F)、5-羟甲基糠醛(HMF)和乙酰丙酸(LA)购自Sigma公司,均为色谱纯。用于预处理的甲酸购自国药集团化学试剂有限公司,为分析纯。绿竹磨木木素采用Argyropoulos 等[14]开发的两步酶水解-弱酸水解的方法进行分离。

1.2绿竹的甲酸预处理

以木素溶出率为因变量,利用Design-Expert 8.0.6(Stat-Ease Inc,美国)统计软件对影响木素溶出率的4个自变量进行四因素五水平的中心复合设计,并以+2、+1、0、-1、-2分别代表自变量的最高、高、中、低和最低水平(见表1),共30组实验。

表1　响应面法优化绿竹甲酸预处理木素溶出率的

注甲酸含量为甲酸在由甲酸和去离子水所组成混合溶液中的体积分数。

甲酸预处理实验。首先取50 g竹粉置于1 L的圆底烧瓶中,添加一定量特定浓度的甲酸溶液,同时加入磁力搅拌子和玻璃珠,配置冷凝管,然后将整个装置放入油浴锅中。待油浴锅升到特定温度时开始计时,预处理结束后,用垫有2层慢速滤纸的布氏漏斗进行固液分离；收集滤液,然后用去离子水将滤纸表面固体基质洗至中性,分散后密封于封口袋中平衡水分。取一定量固体基质,在105℃干燥后测定固体基质得率,其余固体基质用于酶水解实验。

1.3木素溶出率的测定

以50%的甲酸溶液为溶剂,配置一定浓度的糠醛、5-羟甲基糠醛和乙酰丙酸溶液,在波长260～450 nm范围内测定其光谱。

称取13.2 mg绿竹磨木木素,将其溶于20 mL 50%的甲酸溶液。以此溶液为母液,然后用50%甲酸溶液将其稀释10、20、30、40、50倍。在紫外-可见光区测定稀释后溶液的光谱,选定特定波长建立标准曲线。取一定量甲酸预处理液,经50%甲酸溶液稀释和0.45 μm水性微孔滤膜过滤后,测定滤液吸光度；基于此吸光度和已建立的标准曲线,可根据式(1)计算木素溶出率(RL)：

(1)

式中,A325为稀释后的甲酸预处理液在325 nm处的吸光度；V为甲酸预处理液体积，L；ε是木素的摩尔吸光系数,L/(mg·cm)；λ是甲酸预处理液的稀释倍数；W1是用于甲酸预处理的竹粉绝干质量,g；CL是竹粉原料中木素含量, %；l为吸光度测定时比色血的宽度，1 cm。

1.4纤维素溶出率的测定

采用两步水解法测定竹粉原料和固体基质中纤维素含量[4]。取0.6 g竹粉(40～60目)置于20 mL血清瓶中,加入6 mL、72 %硫酸溶液和磁力搅拌子,在30 ℃水浴中反应1 h；第一步酸水解结束后,将固液混合物倒入250 mL厚壁耐压瓶(北京欣维尔玻璃仪器有限公司)中,然后加入168 mL去离子水,使硫酸稀释至4%,然后用聚四氟乙烯盖密封后在121℃油浴中反应1 h；反应结束后,用冷水终止反应,取1 mL上清液,经NaOH溶液中和后,用生化分析仪(YSI 2900D,Yellow Springs Instrument Co.)测定其葡萄糖质量浓度。甲酸预处理后绿竹纤维素溶出率(RC)的计算见式(2)和式(3)：

(2)

(3)

式中,Cg为葡萄糖质量浓度,g/L；V为两步水解最终的液体体积,mL；W2为加入竹粉的绝干质量,g；C1和C2分别为竹粉原料和固体基质中纤维素的含量, %；YS为甲酸预处理后固体基质的得率, %。

1.5固体基质的酶水解

按照参考文献[15]的方法,固体基质(质量分数2%)的酶水解在恒温空气浴摇床(481HP,Waltham)中进行,以pH值4.8、50 mmol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲溶液,纤维素酶(Celluclast 1.5 L)和纤维二糖酶(Novozyme 188)的用量(对绝干固体基质)分别为15 FPU/g和22.5 CBU/g,酶水解温度和转速分别为50℃和200 r/min。酶水解72 h 后,取1 mL上清液,用生化分析仪测定其葡萄糖质量浓度。固体基质中纤维素酶水解转化率(CEC)和葡萄糖得率(YG)分别按照式(4)和式(5)计算。

(4)

YG=CEC×(1-RC)

(5)

式中,ψ是酶水解液中固体基质的质量分数, %；W3是加入固体基质的绝干质量,g；β是固体基质的纤维素含量, %。

2结果与讨论

2.1紫外光谱法测定木素质量浓度时测定波长的优化

对于酸法预处理,除木素溶出外,碳水化合物也会发生酸性降解反应,产生的物质(如呋喃化合物和乙酰丙酸)在紫外光区也有吸收[16]。木素及干扰物的紫外光谱图如图1所示。由图1可知,在 300 nm 前,50%的甲酸溶液具有一定的吸收；而在320 nm前,LA、F和HMF不仅分别在260、278和286 nm处具有最大吸收,三者在260～320 nm均具有明显吸收,其可对甲酸预处理液中木素质量浓度的测定产生较大干扰。因此,木素的测定波长应在260～320 nm区域外进行选择。

值得注意的是,绿竹磨木木素的甲酸溶液不仅在上述碳水化合物降解产物紫外光吸收区域具有吸收,在320～420 nm区域也有吸收。在此区域,甲酸及其他碳水化合物降解产物均无吸收,不会对木素质量浓度的测定产生干扰。木素质量浓度相同时选择较大吸光度所处的波长(325 nm)作为其测定波长。绿竹磨木木素质量浓度与其在325 nm 处建立的标准曲线如图2所示。从图2可以看出,在325 nm处,绿竹磨木木素质量浓度与其吸光度之间遵循朗伯-比尔定律,R2>0.99。因此,后续实验中甲酸预处理液中木素质量浓度的测定基于此波长处的线性曲线。

图1　木素及干扰物的紫外光谱图

2.2甲酸预处理脱木素工艺的响应面法优化

图2　绿竹磨木木素质量浓度与其吸光度在325 nm处建立的标准曲线

对于甲酸预处理,甲酸含量(X1)、液比(X2)、最高温度(X3)和保温时间(X4)均可对木素溶出率产生影响。假设任意2个影响因素间均存在交互影响,则可根据全因素二次回归方程对木素溶出率进行拟合,拟合结果如表2所示。

经最小二乘法拟合,二次回归方程中4个自变量及其交互所形成复合因素的系数拟合如表3所示。拟合模型及其检验如表4所示。对于拟合模型,其变异系数越低,表明实验的可信度和精确度越高[17]；信噪比是有效信号与噪声的比值,其大于4.0视为合理。实验测得木素溶出率与模型预测值之间的关系如图3所示。从表4和图3可以看出,模型Ⅰ的变异系数和信噪比分别为9.37%和25.25,其实测值与预测值的相关系数(R2)高达0.94以上,表明该预测模型不仅具有较高的可信度和精确度,其预测效果也较好。然而,模型Ⅰ中包含14个参数,模型稍显复杂。为简化模型,还需对各参数的显著性进行判定。

表4　拟合模型及其检验

表2　以木素溶出率为因变量的四因素五水平

根据上述各单一和复合参数显著性的判定,模型Ⅰ的二次回归方程可简化为模型Ⅱ。相对于模型Ⅰ,尽管模型Ⅱ的变异系数增大了1个百分点,但其模型参数从14个降至5个,可显著简化模型,增强其应用性。除变异系数外,模型Ⅱ的信噪比则从模型Ⅰ的25.25上升到31.13,进一步增强了模型的稳定性。对于预测的准确性而言,模型Ⅱ所得预测值与实测值的相关系数(R2)也高于0.91。综合可知,以单一和复合参数显著性为判定依据来简化二次回归方程的方式具有可行性,所得简化模型可较好地预测绿竹甲酸预处理过程中木素的溶出率。

表3　4个自变量及其交互影响的显著性判定

注X0为二次方程的常数项；**表示存在显著性。

2.3木素溶出率对纤维素酶水解转化率和葡萄糖得率的影响

图3　实验测得木素溶出率与模型预测值之间的关系

木素溶出率(RL)对绿竹纤维素酶水解转化率(CEC)和葡萄糖得率(YG)的影响如表5所示。从表5可看出,当纤维素酶和纤维二糖酶的用量分别为15 FPU/g和22.5 CBU/g时,未经甲酸预处理的绿竹纤维素酶解转化率低于5%。随木素溶出率的不断提高,纤维素酶水解转化率也随之提高。经曲线拟合可知,木素溶出率与纤维素酶水解转化率之间呈指数关系,其拟合方程为CEC=96.7+93.0/e0.04RL,R2=0.998。由此可见,根据表4中的模型Ⅱ可预测绿竹甲酸预处理过程中木素的溶出率；基于此指数函数,可进一步预测固体基质中纤维素的酶水解转化率。

表5　木素溶出率对绿竹纤维素酶水解

从表5还可看出,随木素溶出率的不断提高,尽管固体基质中纤维素酶水解转化率不断提高,绿竹中纤维素溶出率也随之提高,但最终酶水解葡萄糖得率呈先升高后降低的变化趋势。例如,当木素溶出率从19.2%提高至50%左右时,固体基质中纤维素酶水解转化率从56.2%提高到88.4%,纤维素溶出率也从5.8%提高到14.8%,但由于纤维素酶水解转化率提高的速率大于纤维素溶出率提高的速率,最终葡萄糖得率从52.9%提高到75.3%；当木素溶出率继续升高,由于纤维素酶水解转化率提高的速率低于纤维素溶出率提高的速率,最终葡萄糖得率从75.3%降至71.5%。从获得更高的可发酵葡萄糖得率的角度来看,绿竹甲酸预处理过程中较优的木素溶出率约为50%。

3结论

3.1影响绿竹甲酸预处理木素溶出率的因素主要包括甲酸含量、液比、最高温度和保温时间；采用Design-Expert统计软件对这4个因素进行四因素五水平的中心复合设计,可获得用于预测木素溶出率的全因素二项式方程(模型Ⅰ),该模型含有14个参数。

3.2以参数的显著性为判定依据,去掉对木素溶出率无显著影响的参数后,全因素二项式方程可精简为仅含5个参数的简化二项式方程(模型Ⅱ)。模型Ⅱ所得预测值与实测值的相关系数高于0.91,信噪比比模型Ⅰ高近20%,表明简化模型可较好地预测绿竹甲酸预处理过程中木素的溶出率,且其稳定性也较高。

3.3固体基质中纤维素酶水解转化率随木素溶出率的提高而提高,但当木素溶出率高于50%以后,纤维素溶出率也随之提高,最终酶水解葡萄糖得率呈先升高后降低的变化趋势。为获得更多的葡萄糖,较优的木素溶出率约为50%。

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(责任编辑：陈丽卿)

Optimizing Lignin Removal of Green Bamboo during Formic Acid Pretreatment

by Response Surface Methodology

TANG Xing-pingLIU JingLUO Xiao-lin*HUANG Liu-lianCHEN Li-hui

(CollegeofMaterialEngineering,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,FujianProvince, 350002)

(*E-mail: xluo53@163.com)

Abstract：Central composite design (four-factor and five-level)of four independent variables influencing lignin removal rate(formic acid charge X1, the ratio of liquor to solid X2, pretreatment maximum temperature X3and the pretreatment time at maximum temperature X4) during formic acid pretreatment of green bamboo was conducted by Design-expert software. Based on this design, a binomial equation with full factors (Model Ⅰ) was developed to predict lignin removal rate. By removing the parameters without influence on lignin removal, the amount of parameters in prediction model was reduced from 14 to 5 based on the significance of single and multi parameters. As a result, a simplified binomial equation was obtained (Model Ⅱ). The coefficient variations (C.V.) of these two prediction models were similar. In the two models, the square of coefficients (R2) of both measured lignin removal rate and prediction value were higher than 0.9. But the ratio of signal-to-noise (SNR) of the simplified equation was 20% higher, which indicating the effectiveness and stability of the simplified model for predicting lignin removal during formic acid pretreatment of green bamboo. The exponential relationship between lignin removal (RL) and cellulose enzymatic conversion (CEC) could be expressed as CEC=96.7+93.0/exp(0.04RL), where R2was about 0.998. With the increase of RL, the cellulose removal (RC) also increased, but enzymatic hydrolysis glucose yield (YG) increased initially then reduced. The optimal RLwas approximately 50%.

Keywords：formic acid pretreatment; response surface methodology; lignin removal rate; cellulose enzymatic hydrolysis; glucose yield

作者简介：唐兴平,男,1958年生；高级实验师；主要研究方向：生物质精炼。

基金项目：国家自然科学基金项目(31300495)；教育部博士点基金项目(20123515120018) ；福建省自然科学基金项目(2013J05041,2014J05028)；中国博士后科学基金项目(2015M571955) ；福建省教育厅科技计划项目(JB13033)。

收稿日期：2015- 08- 09

中图分类号：TS749+.3

文献标识码：A

文章编号：1000- 6842(2015)04- 0001- 06

*通信联系人：罗小林,E-mail:xluo53@163.com。