环状RNA研究进展

付海璐，迟鑫明，邵淑娟

(大连医科大学 基础医学院，辽宁 大连 116000)

环状RNA研究进展

付海璐，迟鑫明，邵淑娟Δ

(大连医科大学 基础医学院，辽宁 大连 116000)

环状RNA是一类非编码RNA，因其呈环状而得名。它稳定且广泛地存在于生物界，是比线性的mRNA含量更丰富的转录本，能够在转录或转录后水平调控多种生命活动，与心血管系统疾病，神经系统退行性疾病及肿瘤等多种危害人类健康的疾病相关。本文总结了环状RNA研究的前沿及经典文献，阐述了环状RNA的产生，分类及分子生物学方面特征。

环状RNA；非编码RNA；分子生物学功能；肿瘤；神经系统退行性病变

随着生物技术及计算机技术的逐步发展，生物体中越来越多的“暗物质”一一被曝光。他们虽然不编码蛋白质，但是却起着重要的调控作用，比如miRNA，lncRNA。近几年，环状RNA正逐渐进入科研工作者的视野。环状RNA(circular RNA)是一类双链闭合RNA，无3’帽子结构及5’poly A尾，长度在几百到几千不等，不受RNA外切酶降解，稳定且广泛地存在于生物界，具有进化保守性[1-4]。环状RNA可以由外显子、内含子或二者反向剪接共同组成[1，5-6]，可存在于细胞质、细胞核、血清外泌体以及唾液当中[7-9]。现已发现并鉴定的环状RNA大部分属于非编码RNA[10]，不编码蛋白却能调控基因的表达。环状RNA的调控表达机制多种多样，他们可以作为“miRNA海绵”，竞争性结合miRNA发挥转录后调控作用[11]；与细胞核内的snRNP或者RNA聚合酶Ⅱ相互作用调控转录[5-6]；或者与转录因子结合，竞争性调控经典的RNA剪接[12]。已有研究表明环状RNA与肿瘤、动脉粥样硬化、神经系统退行性病变有着密切关系[13-14]。

1 环状 RNA的发现

1976年，Sanger研究团队提出，高等植物中的类病毒为一种单链环状闭合的RNA病毒，并将这种RNA称为环状RNA(circular RNA)[15]。由此，环状RNA的概念第一次被提出。早期，环状RNA被视为错误剪接产物[16-17]，或是逃脱内含子套索脱枝的中介物[17-18]，只存在于病毒等病原体中[19]。因此，在接下来的四十多年中，环状RNA的研究一直处于比较低迷的状态。近年来，随着测序技术的提高以及相应序列匹配算法的改进，研究人员得以对环状RNA进行更为深入、广泛的研究。2012年，有研究表明，环状RNA稳定且广泛地存在于包括人类在内的真核生物界，且极有可能是主要的转录产物[1，3]。至此，环状RNA的存在再次引起了研究者的广泛重视。

2 环状RNA的合成

目前比较公认的环状RNA合成机制主要有2种：① “直接反向剪接”，或称为“内含子配对驱动环化”[20-21]；②“套索驱动环化”，也被称为“外显子跳读”[22-24]。多项研究表明，“直接反向剪接”是外显子环状RNA的主要产生方式。与经典的线性RNA可变剪接不同，反向剪接(back splicing)的过程是由前体mRNA下游序列(3’端)反向地与其上游的RNA序列(5’端)相连形成环状RNA[3，25-26]。尽管如此，反向剪接却与经典剪接共享剪接信号以及剪接体，并且与经典的RNA剪接具有竞争关系[12]。大部分环状RNA产生在经典的已注释剪接位点[24，27]，但有研究证明次要剪接位点的未注释外显子区也可形成环状RNA[28]。关于促进RNA呈环的动力目前尚未有定论，但研究发现以下几点可能与反向剪接发生相关：①外显子的长度。外显子序列越长，呈环能力越强[1]；②反向剪接反转起始部位富含ALU重复序列(是正常的5倍左右)[4]；③反向剪接位点两侧的内含子较普通内含子更长，并且有促进呈环的作用[2，12]。

3 环状RNA的分类

根据组成不同，环状RNA可分为外显子环状RNA，内含子环状RNA及内含子外显子共同组成的环状RNA。目前，研究发现最多的是由外显子组成的环状RNA，这类环状RNA的产生主要依赖于直接反向剪接机制，大多来源于编码基因，但是绝大部分不能编码蛋白[1，4，10]。在细胞内主要定位于细胞质，含量也因细胞种类而异[2]，并且未表现出与线性mRNA含量的明显相关性。直到2013年，研究发现完全由内含子构成的环状RNA，并称之为ci RNA(circular intronic RNAs)。它们的形成与RNA剪接过程中的套索结构脱枝失败相关，因此没有环状RNA经典的3’-5’ 连接，取而代之的是套索结构遗留的2’-5’连接。ciRNA的产生依赖于5’剪接区域7nt长的富含GU的序列及靠近分枝点的11nt的富含C的序列。这类ci RNA存在于细胞核，少见miRNA结合位点，但是能够结合到母基因上，调控亲本基因的表达[5]。最近，中科大研究人员在人类细胞系中发现了多种由外显子和内含子共同构成的环状RNA，并将这类环状RNA命名为EIciRNA(Exon-intron circular RNAs)，这类环状 RNA通过直接反向剪接产生，存在于细胞核中，与U1 snRNP相互作用并促进亲本基因的转录[6]。

4 环状RNA的总体特征

4.1 极高的稳定性 环状RNA呈闭合环状，缺少3’末端和5’poly A尾[29]，因此不易被RNA核酸外切酶R及脱枝酶降解，具有极高的稳定性。一般来说，外显子环状RNA在细胞或组织中非常稳定，大多数半衰期在48h以上[4]，比线性mRNA 10h的半衰期[30]更为稳定。这也可以解释为什么环状RNA要比线性mRNA的丰度更高。

4.2 种类繁多且数量庞大，分布广泛 大量研究显示，环状RNA广泛存在于生物界，从病毒、果蝇到包括人在内的多种原核及真核生物体内都有大量的环状RNA存在，占母基因转录本的5%～10%，是比mRNA丰度更高的主要转录本[4，10，27，31-32]，有深度测序表明每8个基因中就有1个能够产生具有达到检测水平的环状RNA，且环状RNA的数目是线性mRNA的10倍以上[3，10，19，33-34]。可以说，环状RNA在生物体内无处不在，无论是细胞质、细胞核、血清外泌体以及人类唾液中均发现了大量的环状RNA[7-9]。

4.3 较强的进化保守性 尽管数量庞大，大部分环状RNA在进化过程中仍具有很强的保守性，脑内的一些环状RNA在人类，小鼠甚至果蝇中都具有相似的序列[35]。这也意味着环状RNA在一些基本的生命过程中具有非常重要的作用。但也有报道指出，由内含子构成的环状RNA-ciRNA并未显示出很强的序列保守性[5]。

4.4 表达的时间-空间特异性 多项研究已经证明许多环状RNA的表达不依赖于其亲本基因的线性mRNA表达，而是随着发育、衰老的进行而发生变化，即所谓的时间特异性。并且，在不同的细胞、组织中，环状RNA的种类和含量也不尽相同[28，35-36]。

5 环状RNA的研究方法

对于环状RNA的经典研究策略主要是通过对去除核糖体RNA(rRNA)及线性RNA(linear RNA)的RNA样本进行测序并比对数据库，鉴定反向剪接序列，并通过RNA酶R处理，发散式引物PCR(divergent primer PCR)，Northern blotting和琼脂糖凝胶电泳进行验证，最终确定环状RNA的性质。由于环状RNA能够被miRNA或ASO等技术降解，因此可以通过敲降或者高表达来研究环状RNA的功能。

随着大数据时代的到来，测序、芯片技术已被普遍应用到环状RNA的发现和分类研究中。2015年，北京大学的黄岩谊、汤富酬课题组开发出了一种polyA非依赖的单细胞通用RNA测序法(single-cell universal polyA-independent RNA sequencing，SUPeR-seq)，为研究环状RNA的生物学功能提供了更为有效的新途径。该方法用具有锚序列的随机引物，取代了传统的oligodT引物，用于cDNA合成，具有极高的敏感性和精确性，可测定单个细胞的polyA(+)RNA和polyA(-)RNA序列，并且基本不受基因组DNA及rRNA污染的影响。研究人员已利用该方法在HEK293细胞中以及小鼠着床前胚胎细胞中分别鉴定了141及2891个环状RNA转录本[37]。另一方面，数据库的建成也为环状RNA的研究提供了极其便利的条件。第一个环状RNA数据库CircNet database[38]已经建成，可以查询到环状RNA的序列，基因组注释，表达概况，以及mi RNA-环状RNA互作网络；另外一个环状RNA数据库circ2Traits则提供了环状RNA及其相关疾病的信息。

6 环状 RNA的生物学功能

1993年，Cell杂志报道了第一个有功能的环状RNA-circRNA Sry。circRNA Sry在成年小鼠睾丸中发现，与小鼠的性成熟相关，当时研究人员认为circRNA Sry呈环形的原因与它在染色体上的位置及周围的基因结构相关[26]。尽管有研究表明环状RNA在体外能够编码蛋白[39]，但目前发现的绝大部分环状RNA不能在体内编码蛋白[10]。已发现的环状RNA的作用主要是调节基因表达，具体机制主要包括以下3种。

6.1 miRNA分子海绵作用 一些环状RNA上具有miRNA结合位点，能够竞争性结合miRNA，从而抑制其对相应mRNA的降解作用，主要见于外显子构成的环状RNA(例如CDR1as，circRNA-SRY以及circRNA-ZNF19等)[3，11-12]。ciRS-7是目前研究比较多的与脑发育相关的环状RNA之一，它是小脑退行性变相关蛋白1(CDR1)编码基因的反义链的一种转录本，因而又称CDR1as。ciRS-7的表达具有明显的组织特异性，在神经组织中含量极高，而在其他组织中含量接近于零。ciRS-7具有超过70个miR-7结合位点，能够在神经组织中大量富集miR-7(其富集能力是其他转录本富集miR-7能力的十倍以上)，抑制miR-7的功能，从而调节下游如 α-synuclein，泛素蛋白连接酶A(UBE2A)等与帕金森病，AD等脑发育疾病相关的因子[40]。已有实验表明， CDR1as会损害斑马鱼的中脑功能，产生与miR-7敲降类似的效果[3，11]。

6.2 调控经典的RNA剪接 circMbl是muscleblind基因的第2个外显子形成的环状RNA，muscleblind能够编码剪接因子MBL，与mRNA的稳定性密切相关。circMbl的侧翼内含子上具有很多MBL蛋白结合位点，具有很强的特异性结合MBL蛋白的能力。2者的结合能够促进circMbl的产生，而相应经典的mRNA剪接就会被竞争性的抑制[12]。

6.3 与转录调控原件结合(RNA聚合酶Ⅱ，snRNP等)调控母基因的转录 见于一些ciRNA(如ci-ankrd52，ci-sirt7)和EliRNA(如circEIF3J or circPAIP2)。Ci-ankrd52是来源于ankrd52的ciRNA，它能够特异性地结合参与其母基因ankrd52转录的RNA polⅡ，调节ankrd52的转录效率。当ci-ankrd52被特异性敲除之后，ankrd52的转录效率明显降低；但是ci-ankrd的高表达却并没有提高ankrd52的转录效率，研究人员推测，这可能是外源性ci-ankrd52的定位异常所引起的[5]。

7 环状RNA与疾病

已有研究证明环状RNA与肿瘤、阿尔兹海默症、动脉粥样硬化、心肌肥大所引起的心力衰竭、肺纤维化等疾病密切相关[40-42]。目前，研究成果主要集中在环状RNA与神经发育和肿瘤2个方向。

7.1 环状RNA与神经系统发育 已经先后有研究表明哺乳动物的脑富含环状RNA，尤其以神经突触部位含量最高[3，12，43-44]，中脑，大脑的新皮质区、海马区、胚胎的新皮质区都存在不同种类的环状RNA，一般来说，神经元越多的部位，环状RNA的含量也越多[3，35]。且这些环状RNA及其两侧内含子的序列都比较保守，其表达丰度也会随神经系统的发育和分化而变化，但是这种变化并未表现出与其对应的线性mRNA的相关性[28，35，43]。环状RNA表达与神经系统发育过程的这种紧密联系，使得它很有可能对一些神经系统发育疾病的诊断和治疗带来新的帮助[40]。

7.2 环状RNA与肿瘤 有研究证明环状RNA与结肠癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、胰腺导管癌、胶质细胞瘤等肿瘤具有密切的联系[13-14，42，45-48]。环状RNA所表现出的广泛存在性，高度稳定性，多种多样的调控功能，无疑为肿瘤的早期诊断和治疗带来了新的曙光。

有临床研究表明，一些环状RNA在肿瘤组织中的含量低于正常组织，并且与肿瘤的远处转移、分期、发病年龄、性别等临床特征具有显著相关性[13-14，42]。并且已经有研究人员在人的唾液和血清外泌体中发现环状RNA的存在，且其中一些环状 RNA在肿瘤患者与正常患者的血清外泌体中的含量呈显著差异[7]。综上，未来环状RNA有望成为肿瘤诊断和分期的新型分子标记物。

另外，已经有许多研究表明，环状RNA与肿瘤的分子生物学过程密切相关，能够直接或间接调节许多肿瘤的发生发展。第一，抑制wnt通路。2015年研究人员发现，环状RNA cir-ITCH在人类食管癌组织中的表达低于癌旁组织，分子生物学实验显示，cir-ITCH能够抑制食管癌细胞系Eca-109 和 TE-1中Wnt通路活性，进而抑制肿瘤的增殖能力、细胞周期进程以及裸鼠成瘤能力[13]。第二，环状RNA也与上皮-间质细胞转化(EMT)过程密切相关。EMT是肿瘤发生及侵袭迁移能力增加过程中的重要事件，2015年有报道显示，在EMT的过程中， QUAKING蛋白能够结合到特定的环状RNA侧翼序列，从而调控这些环状RNA的产生，而这类环状RNA的数目达到了上千种，这也暗示着环状RNA与肿瘤发生极有可能有着千丝万缕的联系[49]。

8 结语

环状RNA在复杂的生命过程中扮演着重要的调控角色，是许多疾病的潜在诊断和治疗靶点。目前对于环状RNA的研究成果仅仅是冰山一角，要揭开环状RNA神秘的面纱，还有漫长的研究道路要走，有理由相信，未来环状RNA在疾病诊断、治疗以及药物研发工作中会有更多用途。

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(编校：谭玲)

Reseach progress of circular RNAs

FU Hai-lu, CHI Xin-ming, SHAO Shu-juanΔ

(College of Basic Medical Sciences, Dalian Medical University, Dalian 116000，China)

Circular RNAs, which belong to non-coding RNAs, are so named for their circular shape. They stably exist in almost all kingdoms of life, accuring to be the most predominant transcripts instead of linear mRNAs. They act as regulators in transcription or posttranscription, playing important roles in tumors, cadiovascular diseases, neurodegenerative diseases and so on. In this paper, we collect information of the most authoritative articles, and elaborate the production, classification and molecular biologic characteristics of circular RNAs.

circular RNA; non-coding RNA; molecular biologic function；tumor； neurodegenerative disease

国家自然科学基金面上项目(81272225)；国家自然科学基金面上项目(81470367)

付海璐，女，博士在读，研究方向：肿瘤分子生物学，E-mail：shandianlulu0416@163.com；邵淑娟，通信作者，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤靶向治疗，肿瘤分子生物学，E-mail：shaoshujuan2006@126.com。

Q71

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.03