COL9A1基因多态性与儿童大骨节病的关联分析

史晓薇，郭　雄

(1.西安交大医学院第一附属医院儿科,陕西 西安 710061；2.西安交通大学环境与基因教育部重点实验室与公共卫生学院地方病研究所，陕西 西安 710061)



COL9A1基因多态性与儿童大骨节病的关联分析

史晓薇1，郭雄2

(1.西安交大医学院第一附属医院儿科,陕西 西安 710061；2.西安交通大学环境与基因教育部重点实验室与公共卫生学院地方病研究所，陕西 西安 710061)

[摘要]目的探讨COL9A1(IX型胶原α1链)基因多态性在儿童大骨节病(Kashin-beck disease，KBD)发病中的作用。方法2015年6至8月西安交大医学部公共卫生学院地病所在陕西省麟游县和永寿县大骨节病区收集35例KBD患儿(病例组)和84例健康儿童(对照组)全血，并提取全血基因组DNA，应用Sequenom assARRAY RS1000分型技术对COL9A1上15个SNPs基因多态性位点进行基因分型，比较病例组与对照组等位基因和基因型的分布差异。结果关联分析发现rs6910140位点突变型等位基因C的频率在病例组为17.1%(12/70)，明显低于对照组的38.1%(64/168)(χ2=11.5，P<0.05)；而在位点rs1135056中，突变型等位基因C的频率在病例组为32.9%(23/70)，明显高于对照组的17.3%(29/168)(χ2=7.03，P<0.05)。两位点的基因型频率分布在两组儿童中也均存在显著性差异(χ2值分别为12.32和10.79，均P<0.05)。结论COL9A1基因多态性与儿童KBD的易患性有关，在rs6910140基因上个体携带等位基因C可能与KBD易患性的降低有关，在基因rs1135056上个体携带等位基因C可能与KBD易患性的增加有关。

[关键词]大骨节病；COL9A1基因；儿童；单核苷酸多态性

大骨节病(Kashin-Beck disease，KBD)是一种地方性、多发性、畸形性骨关节病，至今原因未明。长期以来认为该病的深层软骨细胞坏死是由环境有害因素所致[1-2]，曾提出环境化学学说(主要有硒缺乏学说)、粮食真菌毒素学说及饮水有机物中毒学说。但环境因素不能完全解释病区的一些流行病学现象：如即使在患病最重的家庭并非所有人均患病等。近年来对KBD的发病特点分析发现，个体的易感性可能在KBD的发病中起一定的作用[3-4]。

KBD是以关节软骨和骺板软骨深层软骨细胞发生坏死继而导致软骨发育障碍的慢性继发性骨关节病，是一种特殊类型的骨关节疾病，其中COL9A1基因是编码IX型胶原的α1链，是透明软骨中的主要胶原成份。研究表明IX型胶原基因突变与多种骨软骨疾病有关[5-6]。COL9A1基因多态性与女性胯关节炎的易感性有关。另有报道表明，COL9A1基因第9外显子的突变与先天性骨骺发育不良相关；但未见其多态性与儿童KBD易感性的报道。本研究首次通过对COL9A1基因多态性在KBD易感人群(儿童)中的关联分析，探讨COL9A1在KBD发病中的作用。

1研究对象和方法

1.1研究对象

按照我国《大骨节病诊断标准》(WS/T 207-2010)进行KBD病例的诊断和排除。2015年6至8月西安交大医学部公共卫生学院地病所对陕西省麟游县和永寿县大骨节病区的119例无亲缘关系(非3代以内亲属)的儿童进行研究，其中包括35例KBD儿童(病例组)和年龄、性别相匹配的84例健康儿童(对照组)。所有研究对象均进行临床和右手正位X片检查，均排除了其它骨关节系统疾病患者。在征得患者及家属知情同意后抽取空腹静脉血5mL。本研究得到了西安交通大学第一附属医院伦理委员会的批准。

1.2 SNPs基因分型

选择COL9A1基因的15个SNPs位点进行研究，位点信息见表1；被选择的SNPs位点在汉族人群中满足r2>0.8和MAF(minor allele frequency)>0.1，全血基因组DNA提取用GoldMag纯化试剂盒(陕西北美基因股份有限公司生产)，DNA浓度检测使用Thermo Fish公司的NaNoDrop 2000c完成。多重PCR引物利用美国Sequenom公司的Assay Design 4.0进行设计，SNPs分型检测使用美国Sequenom公司的MassArrayRS1000飞行质谱平台，检测数据由Sequenom公司的Typer 4.0软件进行管理和分析。

表1COL9A1基因的研究位点信息比较结果

Table 1The loci information of the studied SNP sin COL9A1 gene

注：a指野生型等位基因/突变性等位基因。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0进行统计分析，SNPs的各基因型频率在对照组中行Hardy Weinberg(HWE)检验[7]；采用χ2检验或Fisher精确检验(超过20%格子理论频数<5或者任何1格理论频数<1时)比较各位点的等位基因频率/基因型频率在两组中的分布；以P<0.05为有显著性差异。

2结果

2.1被研究人群一般信息

本研究包括35例KBD儿童和84例年龄、性别匹配的健康儿童，两组儿童性别构成(男/女：17/18与42/42；χ2=0.02，P>0.05)和平均年龄(11.30±6.79岁与11.97±7.85岁；t=0.58，P>0.05)比较均无显著性差异。35例病例组儿童包括32例Ⅰ期和3例Ⅱ期KBD患儿。

2.2 COL9A1基因15个多态性SNPs位点与大骨节病关联性

本次研究中15个SNPs位点在84例正常儿童的HEW检验结果见表1，P=0.14～0.93，均P>0.05，表明分型结果符合遗传学定律。位点rs6910140和rs1135056等位基因(2个位点的野生型/突变型等位基因均为T/C)频率在两组儿童中均有显著性差异(均P<0.05)。rs6910140位点等位基因C的频率在病例组为17.1%(12/70)，明显低于对照组的38.1%(64/168)，χ2=11.5，P<0.05。在位点rs1135056中，等位基因C的频率在病例组为32.9%(23/70)，明显高于对照组的17.3%(29/168)，χ2=7.03，P<0.05。位点rs6910140中病例组儿童TT/TC/CC基因型的频率为62.9%(22/35)、34.3%(12/35)和2.8%(1/35)与对照组的构成比30.9%(26/84)、63.1%(53/84)和5.9%(5/84)比较有显著性差异(χ2=12.32，P<0.05)。位点rs1135056中病例组儿童TT/TC/CC基因型的频率为34.3%(12/35)、62.9%(22/35)和2.8%(1/35)，与对照组的构成比66.7%(56/84)、32.1%(27/84)和1.2%(1/84)比较有显著性差异(χ2=10.79，P<0.05)。其余位点未发现有统计学差异，提示COL9A1基因多态性与儿童KBD的易患性有关，在rs6910140基因上个体携带等位基因C可能与KBD易患性的降低有关，在基因rs1135056上个体携带等位基因C可能与KBD易患性的增加有关。15个SNPs位点等位基因及基因型分布，见表2。

注：a野生型等位基因纯合子/杂合子/突变型等位基因纯合子。

3讨论

3.1 COL9A1基因多态性与骨关节病的易感性有关

大骨节病的病因不清，遗传因素可能与个体的易感性有关[8]。KBD和关节炎(OA)有类似的病理学特征，如软骨细胞坏死、细胞凋亡、金属基质蛋白退行性变化等。IX型胶原与骨关节疾病的关系已得到了专家的共识，COL9A1基因是编码IX型胶原的α1链，COL9A1基因的多态性与骨关节病的易感性有关。5～13岁儿童是KBD的易患人群，本文通过关联分析，探讨COL9A1基因多态性在KBD儿童发病中的作用。

3.2 COL9A1基因中的rs6910140和rs1135056多态性与儿童大骨节病易感性有关

本文对COL9A1基因上的15个SNPs位点在KBD儿童中的研究发现，有2个SNPs位点(rs6910140和rs1135056)与儿童KBD相关联。在rs6910140位点病例组儿童TT/TC/CC基因型的频率为62.9%、34.3%和2.8%与对照组的构成比30.9%、63.1%和5.9%比较有显著性差异(P<0.05)，且突变型等位基因C的频率在病例组为17.1%，明显低于对照组的38.1%，对照组儿童携带C等位基因频率高，说明在基因rs6910140上，个体携带C等位基因者，其KBD的易患性降低。在位点rs1135056中病例组儿童TT/TC/CC基因型的频率为34.3%、62.9%和2.8%与对照组的构成比66.7%、32.1%和1.2%比较有显著性差异(P<0.05)，且突变型等位基因C的频率在病例组为32.9%，明显高于对照组的17.3%，病例组儿童携带C等位基因频率高，说明在基因rs1135056上，个体携带C等位基因者，其KBD的易患性增加。本次研究结果支持COL9A1基因多态性与KBD易患性有关。目前位点rs6910140和rs1135056多态性在骨关节病中作用机制的研究报道较少，推测其与改变了a1(IX)蛋白表达的导致软骨退行性改变与KBD的发病有关。a1(IX)在KBD患者骨关节中表达有待进一步研究。

综上所述，COL9A1基因多态性与儿童KBD易患性有关，当然这些结论有待于今后在其它人群和较大样本量中研究验证。

[参考文献]

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[2]Wang S, Duan C, Zhang F,etal.Regulatory gene networks and signaling pathways from primary osteoarthritis and Kashin-Beck disease, an endemic osteoarthritis, identified by three analysis software[J].Gene,2013,512(1):89-96.

[3]史晓薇,郭雄,张峰,等.基质金属蛋白酶-3基因多态性与儿童大骨节病关联分析[J].中国妇幼健康研究,2014,25(5):715-717.

[4]Shi X W, Guo X, Lv AL,etal.Heritability estimates and linkage analysis of 23 short tandem repeat loci on chromosomes 2, 11, and 12 in an endemic osteochondropathy in China[J].Scand J Rheumatol,2010,39(3):259-265.

[5]Imagawa K, de Andrés M C, Hashimoto K,etal.Association of reduced type IX collagen gene expression in human osteoarthritic chondrocytes with epigenetic silencing by DNA hypermethylation[J].Arthritis Rheumatol,2014,66(11):3040-3051.

[6]Brachvogel B, Zaucke F, Dave K,etal.Comparative proteomic analysis of normal and collagen IX null mouse cartilage reveals altered extracellular matrix composition and novel components of the collagen IX interactome[J].J Biol Chem,2013,288(19):13481-13492.

[7]Waltrick-Zambuzzi M, Tannure P N, Vieira T C,etal.Genetic Variants in Folate and Cobalamin Metabolism-Related Genes in Nonsyndromic Cleft Lip and/or Palate[J].Braz Dent J,2015,26(6):561-565.

[8]Zhang F, Wen Y, Guo X,etal.Genome-wide association study identifies ITPR2 as a susceptibility gene for Kashin-Beck disease in Han Chinese[J].Arthritis Rheumatol,2015,67(1):176-181.

[专业责任编辑：潘凯丽]

Association study of polymorphism of COL9A1 gene and the risk of Kashin-Beck disease in children

SHI Xiao-wei1, GUO Xiong2

(1.Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Medical Collage, Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China;2. Faculty of Public Health, Ministry of Education Key Laboratory of Environment and Genes Related to Disease,Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

[Key words]Kashin-Beck disease (KBD); COL9A1 gene; children; single nucleotide polymorphism

[Abstract]Objective To investigate the role of α1 of type IX collagen gene (COL9A1) in the pathologenesis and progression of Kashin-Beck disease (KBD) in children. Methods Genomic DNA of whole blood was collected from 35 KBD cases (case group) and 84 healthy children (control group) in Linyou County and Yongshou County of Shaanxi Province where faculty of public health of Xi’an Jiaotong University was from June to August in 2015. Fifteen SNPs in COL9A1 genotypes were conducted using Sequenom assARRAY RS1000. The frequencies of alleles and genotypes were compared between two groups. Results The allele frequency of mutant allele C in rs6910140 was 17.1% (12/70) in case group, which was significantly lower than 38.1% (64/168) in control group (χ2=11.5,P<0.05). But in locus rs1135056, the allele frequency of mutant allele C was 32.9% (23/70), which was higher than 17.3% (29/168) in control group (χ2=7.03,P<0.05). The frequencies of the genotype in two loci were significantly different in two groups (χ2value was 12.32 and 10.79, respectively, bothP<0.05). Conclusion Polymorphism of COL9A1 gene is associated with the liability of KBD in children. The subjects carrying allele C in rs6910140 have lower risk of KBD but those carrying allele C in rs1135056 have higher risk of KBD.

[收稿日期]2016-03-25

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.81273007)

[作者简介]史晓薇(1971-)，女，副主任医师，博士，主要从事儿童保健的研究。

[通信作者]郭雄，教授。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.05.002

[中图分类号]R684.1

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5293(2016)05-0556-02