microRNA-135a在阿尔茨海默病患者中的检测价值

刘辰庚　孟　双　张跃其　王培昌

(首都医科大学宣武医院检验科，北京　100053)



microRNA-135a在阿尔茨海默病患者中的检测价值

刘辰庚孟双1张跃其王培昌

(首都医科大学宣武医院检验科，北京100053)

摘要〔〕目的初步探讨microRNA-135a(miR-135a)作为阿尔茨海默病(AD)生物标志物的潜在价值。方法使用实时定量PCR检测痴呆期AD(DAT)患者、轻度认知障碍(MCI)患者和表面健康受试者血清和脑脊液中miR-135a含量。结果MCI和DAT患者血清miR-135a水平均低于对照组(P<0.05)，且DAT组低于MCI组(P<0.05)；MCI和DAT患者脑脊液总体miR-135a水平均低于对照组(P<0.05)，且DAT组低于MCI组(P<0.05)；且miR-135a对于早期AD的诊断价值可能优于Aβ42。结论血清miR-135a可能为AD，特别是早期AD诊断的标志物。

关键词〔〕阿尔茨海默病；微小RNA；生物标志物

1中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

第一作者：刘辰庚(1980-)，男，博士，主管技师，主要从事衰老和相关疾病标志物筛选研究。

目前对痴呆期阿尔茨海默病(AD)(DAT)患者缺乏有效的治疗手段〔1〕。β淀粉样蛋白(Aβ42)、p-tau等对轻度认知障碍(MCI)和临床前期AD患者的诊断阳性率并不令人满意〔2,3〕。本文在前期研究的基础上〔4〕，检测分析MCI和DAT患者脑脊液(CSF)和血清中的microRNA(miR)-135a的变化，初步分析其作为AD早期诊断标志物的价值。

1材料与方法

1.1临床资料随机选取2012年1月至2015年1月就诊于宣武医院的AD患者共162例，其中MCI 63例(男33例，年龄中位数61岁；女30例，中位年龄65岁)；DAT患者99例(男41例，中位年龄72岁；女58例，中位年龄76岁)。MCI和DAT均符合诊断标准〔5,6〕。分别针对MCI和DAT组随机选取健康受试者各60例为对照组(MCI对照组：男30例，中位年龄61岁；女30例，中位年龄65岁。DAT对照组：男30例，中位年龄72岁；女30例，中位年龄76岁)。采集全部受试者的血液标本和其中25例患者的CSF标本(8例MCI：男性，中位年龄61岁。17例DAT：男8例，中位年龄70岁；女9例，中位年龄68岁)。CSF标本的对照组选取无痴呆、肿瘤和感染性疾病且CSF生化、细菌、常规结果正常的标本，并保证性别年龄匹配。本研究经宣武医院伦理委员会审核批准。

1.2标本采集受试者空腹12 h后分别使用肝素抗凝管和促凝管采集静脉血，抽血后1 h内以3 000 r/min、7 min分离血浆或血清。抽血后1 h内由神经内科医生按照相应操作规程抽取CSF标本2 ml。标本在分析前保存于液氮中。

1.3小RNA提取及miR-135a测定使用天根公司(TIANGEN)miRcute miR亲和柱提取小RNA，按说明书操作。以提取小RNA前向标本中加入的Ce_miR-39为内参，使用2-△△CT法计算miR-135a水平〔7〕。

1.4内参稳定性试验将表面健康受试者的混合血清分为20份，每份标本分别加入Ce_miR-39并分20次分别进行小RNA提取和miR-135a检测，计算批间变异系数。

1.5Aβ42检测使用CUSABIO公司的ELISA试剂盒对CSF和血清标本中的Aβ42进行定量测定，按照说明书进行操作。

1.6统计学分析使用MedCalc V11和StatFlex V6软件进行统计分析：使用Kolmogorov-Smirnov检验分析资料是否呈正态分布;Kruskal-WallisH检验比较不同年龄组间差异；Mann-WhitneyU检验比较性别差异；相同患者不同标本检测组间比较使用配对t检验；偏态分布的资料参考区间用(P2.5～P97.5)表示〔8〕。

2结果

2.1内参稳定性实验20份混合血清标本miR-135a检测结果的批间变异系数为9.15%。

2.2血液和CSF标本miR-135a检测同一受试者血清标本(n=10，数据标注化至1.00)中miR-135a略高于血浆(对照组分别为0.98、0.99、0.96、0.95；MCI组分别为0.94、0.99、0.96；DAT组0.97、0.99、0.97)，但无统计学差异(P>0.05)；血清和血浆标本miR-135a相关系数(r2)为0.979。MCI(0.60±0.15)和DAT患者(0.41±0.11)血清miR-135a水平均低于对照组(0.86±0.19，P<0.05)，且DAT组低于MCI组(P<0.05)。MCI(0.73±0.19)和DAT患者(0.24±0.09)脑脊液总体miR-135a水平均低于对照组(1.00±0.25)(P<0.05)，且DAT组低于MCI组(P<0.05)。

2.3miR-135a与Aβ42检测数据DAT患者脑脊液Aβ42(1.11±0.17)显著低于MCI(1.93±0.21)和对照组(2.25±0.25)(P<0.05)，且MCI组低于对照组(P<0.05)。DAT患者血清和CSF miR-135a与CSF Aβ42的相关系数(r2)分别为0.771和0.615，血清Aβ42与血清和CSF miR-135a均无相关性(P>0.05)。MCI患者血清和CSF miR-135a与CSF Aβ42的相关性略低，相关系数(r2 )分别为0.652和0.529，血清Aβ42与血清和CSF miR-135a均不具相关性(P>0.05)。表面健康受试者血清miR-135a水平呈偏态分布，同龄男女对照组和不同龄对照组的检测结果无统计学差异(P>0.05)，故生物参考区间不需按性别年龄分组，为0.60～1.10。据此区间，本研究MCI受试者血清miR-135a的阳性率为63.5%(40/63)，DAT受试者为81.8%(81/99)，分别高于CSF Aβ42的40.3%和72.2%。

3讨论

目前AD的临床诊断主要依赖于神经心理学评分和标志物检测。神经心理学评分方法便捷、容易实施，但对痴呆前阶段患者缺乏满意的辨识率〔1～3,9〕；影像学标志物如氟脱氧葡萄糖-PET成像、淀粉样蛋白PET成像等对痴呆前阶段诊断有较大帮助，但其技术复杂且动辄万元的检测费用多数患者难以承受，故开展较少。体液标志物具有检测便捷、易于标准化、可组合检测及价格相对低廉等特点，更加适用于早期筛查〔10〕。

目前被广泛承认的AD体液生物标志物如Aβ、tau蛋白、p-tau蛋白等大都来源于CSF，检测血液中的上述标志物对其诊断意义不大〔10,11〕。对于AD特别是早期AD的检测/筛查而言，寻找血液、尿液等较易获取的标本中的标志物尤为重要；但目前研究较多的血液、尿液中的标志物如血小板APP异构体比值、载脂蛋白E、AD7c-NTP、同型半胱氨酸等的特异性和敏感性并不理想，仅能作为辅助指标〔2,9～11〕。据此，2014年1月，来自多个国家的20余名专家联名撰文呼吁〔12〕：研究者应继续着力寻找AD血液学标志物。miR具有分子量小、在体液中能稳定存在、可定量检测等特性，是潜在的疾病标志物，miR在AD诊断、特别是早期诊断中的价值已成为研究热点。

miR是一类内生的、长度约19～24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。我课题组前期研究发现，APP/PS-1双转基因AD小鼠模型海马组织中miR-135a较野生型小鼠显著下调〔4〕，且AD小鼠模型CSF和血清中的miR-135a亦显著下调；目前并没有药物来对晚期AD进行有效治疗〔2,12〕。由于miR-135a相对BACE-1和Aβ42而言处于生物级联作用的上游，故miR-135a可能对于AD的早期诊断有潜在帮助。这个猜想也在与Aβ42阳性率的横向比较中得以印证-外周血miR-135a可能是较Aβ42更适宜的AD诊断，特别是早期诊断的标志物。目前尚无直接证据表明miR能自由地通过血脑屏障，miR能存在于外吐小体和微囊泡中，并经小泡的转运而由CSF入外周血或由外周血入CSF。有人甚至认为，细胞就是以外吐小体和微囊泡形式对外分泌miR〔13〕，这些外吐小体和微囊泡可能包含了分泌细胞要传达给外界的信息。故作为在脑组织中高表达，在外周器官低表达的miR在外周血中含量的变化很可能是由脑组织向外周血对其释放的多寡所导致。

参考文献4

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4Liu CG,Wang JL,Li L,etal.MicroRNA-384 regulates both amyloid precursor protein and β-secretase expression and is a potential biomarker for Alzheimer's disease 〔J〕.Int J Mol Med,2014;34(1):160-6.

5贾建平,陆璐,张逸驰,等.美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会诊断指南写作组:阿尔茨海默病源性轻度认知障碍诊断标准推荐 〔J〕.中华神经内科杂志,2012;45(5):345-51.

6贾建平,陆璐,张逸驰,等译.美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会诊断指南写作组:阿尔茨海默病痴呆诊断标准的推荐〔J〕.中华神经内科杂志,2012;45(5):352-5.

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13Kooijmans SA,Vader P,van Dommelen SM,etal.Exosome mimetics:a novel class of drug delivery systems 〔J〕.Int J Nanomedicine,2012;7:1525-41.

〔2015-03-17修回〕

(编辑徐杰)

·其他·

The detection of microRNA-135a in the patients of Alzheimer′s disease

LIU Chen-Geng, MENG Shuang, ZHANG Yue-Qi,etal.

Clinical Laboratory of Xuanwu Hospital, Captital Medcial University, Beijing 100053, China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the clinical value of microRNA-135a (miR-135a) in the detection of Alzheimer′s disease (AD).MethodsThe levels of miR-135a in mild cognitive impairment (MCI), dementia of Alzheimer′s type (DAT) and control group were tested.ResultsThe miR-135a levels in cerebro-spinal fluid from MCI and DAT were significantly higher than those of control (P<0.05), and it was lower in DAT group than that of MCI group(P<0.05). The miR-135a levels in serum from MCI and DAT were significantly lower than those of control(P<0.05), and it was lower in DAT group than that in MCI group(P<0.05). Furthermore, miR-135a might be a better marker than Aβ42 for early diagnosis of AD.ConclusionsThe serum miR-135a was a potential biomarker of AD, especially for its early stage.

【Key words】Alzheimer′s disease; micrnRNA; Biomarker

通讯作者：王培昌(1965-)，男，主任技师，教授，博士生导师，主要从事衰老和相关疾病机制研究及标志物筛选研究。

基金项目：国家自然科学基金青年基金(No.81401734)；北京市医院管理局“青苗”计划专项经费资助(QML20150804)

中图分类号〔〕R749〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0152-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.072