梯度洗脱HPLC法测定环丙氨嗪有关物质

陆春波，王霞，张航俊，穆琳

(1.浙江省兽药饲料监察所，杭州310012；2.浙江国邦药业有限公司，浙江绍兴312500)

梯度洗脱HPLC法测定环丙氨嗪有关物质

陆春波1，王霞2，张航俊1，穆琳1

(1.浙江省兽药饲料监察所，杭州310012；2.浙江国邦药业有限公司，浙江绍兴312500)

建立了梯度洗脱HPLC法测定环丙氨嗪有关物质。采用Agilent Eclipse plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相A为0.02 mol/L醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，线性梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长为213 nm。试验结果显示,环丙氨嗪与已知5种杂质峰完全分离。本方法简单灵敏，可用于环丙氨嗪中有关物质的检测。

环丙氨嗪;有关物质;梯度洗脱HPLC

环丙氨嗪，化学名为2-环丙氨基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪，是FDA和EPA(美国环境保护协会)于1974年正式批准生产的新型杀虫剂，1975年在美国上市，商品名为Cyromazine，美国药典[1]收载此产品。1999年9月我国批准1%的环丙氨嗪预混剂在我国上市[2]，环丙氨嗪标准收载于《兽药国家标准(化学药品、中药卷第一册)》[3]，采用2个薄层色谱的方法来控制有关物质。本试验建立

了梯度洗脱HPLC法测定环丙氨嗪有关物质，以期为修订环丙氨嗪质量标准做技术储备。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪，配Waters 2996二极管阵列检测器，美国Waters公司； XS-205电子天平(感量0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂与材料 甲醇为色谱纯，Merck 公司，其余试剂均为分析纯；实验用水为milli-Q超纯水。环丙氨嗪(批号为130729-1、131005-2、131006-1、131008-1)，由浙江甲公司生产；环丙氨嗪(批号为212025)，由上海乙公司生产；环丙氨嗪(批号为20130401)，由山东丙公司生产。环丙氨嗪对照品(批号H0501307，含量99.4%)，购于中国兽医药品监察所；2,4,6-三氨基三嗪(简称杂质A)对照品，批号10907，含量99.5%，购于Dr.E；2-氯-4,6-二氨基三嗪(简称杂质B)对照品，批号H0530806，购于中国兽医药品监察所；6-氨基-2-氯-4-环丙氨基三嗪(简称杂质C)对照品，批号H0550806，购于中国兽医药品监察所；2-氨基-4,6-双环丙氨基三嗪(简称杂质D)对照品，批号H0520806，购于中国兽医药品监察所；2,4,6-三环丙氨基三嗪(简称杂质E)对照品，批号H0540806，购于中国兽医药品监察所。

2 方法和结果

2.1 液相色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.02 mol/L醋酸铵溶液为流动相A，甲醇为流动相B；检测波长213 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min。梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱表

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液 精密称取环丙氨嗪供试品20 mg，置50 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸铵溶液-甲醇(80∶20)适量，超声10 min，冷却，加0.02 mol/L醋酸铵溶液-甲醇(80∶20)稀释至刻度，作为供试品溶液。2.2.2 对照溶液配制 精密量取上述供试品溶液1 mL，置200 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸铵溶液-甲醇(80∶20)稀释至刻度，作为对照溶液。2.2.3 混合对照品溶液 分别精密称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和环丙氨嗪的对照品各10 mg，分别置100 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸铵溶液-甲醇(40∶60)溶解并稀释至刻度；精密量取上述溶液各2 mL，置同一50 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸铵溶液-甲醇(80∶20)稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.3 专属性 量取空白溶液和混合对照品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，考察环丙氨嗪与5种杂质的分离度，结果见图1。结果表明，在上述色谱条件下，空白溶液对杂质没有干扰，环丙氨嗪峰和相邻杂质峰(杂质B)的分离度为18.6，同时供试品溶液中杂质峰的保留时间与混合对照品溶液中杂质峰的保留时间一致。出峰顺序依次为杂质A、杂质B、环丙氨嗪、杂质C、杂质D和杂质E。

2.4 检测限和定量限 按照信噪比S/N≥3的判断指标，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的检测限分别为0.2、0.2、0.1、0.1、0.1 μg/mL。按照信噪比S/N≥10的判断指标，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的定量限为0.6、0.6、0.3、0.3、0.3 μg/mL。杂质对照品A标有含量，其他杂质对照品没有标示含量，检测限和定量限的测定时杂质对照品的含量均以100%计。2.5 样品的测定 精密量取供试品溶液、对照溶液、混合对照品溶液各10 μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按此方法对3家企业6批次的环丙氨嗪样品进行了检测，经与有关物质混合对照品溶液的保留时间对照，确定浙江甲公司检出杂质C和杂质D，上海乙公司检出杂质A 和杂质D，山东丙公司检出杂质B和杂质D。供试品溶液中杂质A、杂质B和杂质D 的峰面积均不大于对照溶液主峰峰面积的4倍(2.0%)，供试品溶液中杂质C和杂质E的峰面积均不大于对照溶液主峰峰面积的0.5倍(0.25%)，结果见表2。

A.杂质A；B.杂质B；C.杂质C；D.杂质D；E.杂质E；HBAQ.环丙氨嗪图1 空白溶剂色谱图(1)、混合对照品溶液色谱图(2)、供试品溶液(0.4 mg/mL)色谱图(3)和对照溶液(2.0 μg/mL)色谱图(4)

有关物质130729-1131005-2131006-1131008-120202520130401-1杂质A未检出未检出未检出未检出17932未检出杂质B未检出未检出未检出未检出未检出7560杂质C14771280481898731100未检出未检出杂质D5812933623376184336226657941952杂质E未检出未检出未检出未检出未检出未检出1/200主峰8908390076843269017285120834571/200主峰0．5倍4454245038421634508642560417281/200主峰4倍356332360304337304360688340480333828

3 讨论

《兽药国家标准(化学药品、中药卷第一册)》(农业部1960号公告)收载有2个环丙氨嗪质量标准，有关物质检查均采用薄层色谱法，第一个标准采用5种杂质对照品的对照法，第二个标准采用自身对照法。查询有关文献报道，这2个标准的测定结果基本一致，可以用自身对照替代对照品对照的方法[4]。本试验只对已知杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E进行了考察，限度参照《兽药国家标准(化学药品、中药卷第一册)》收载的第二个标准，杂质A、杂质B和杂质D的斑点颜色不得过对照溶液的主斑点(2%)；杂质C和杂质E的斑点颜色不得过对照溶液的主斑点(0.25%)。本试验采用液相色谱的自身对照法，因对照溶液浓度为供试品溶液浓度的1/200，故限度设为“供试品溶液中如有杂质峰，杂质A、杂质B和杂质D 的峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的4倍(2.0%)，供试品溶液中杂质C和杂质E的峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.25%)。”

采用DAD在200～400 nm进行全波长扫描，考察杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E各杂质的混合溶液在200～400 nm的紫外吸收情况，最大吸收波长分别为205.0、208.5、214.4、213.2、220.3 nm。均在205～220 nm之间，最后确定测定波长为214 nm。

由于5种杂质极性差别很大，采用等度洗脱0.02 mol/L醋酸铵溶液-甲醇(80∶20)，杂质E出峰时间超过60 min；采用等度洗脱0.02 mol/L醋酸铵溶液-甲醇(50∶50)，杂质A、杂质B与环丙氨嗪不能完全分离；采用本文的梯度洗脱方法，使得环丙氨嗪与相邻杂质B完全分离，各杂质的出峰时间相对较慢，各杂质峰间的分离更好。

由于环丙氨嗪的生产工艺不同，各企业在合成环丙氨嗪的过程中会产生不同的有关物质，本试验所检测的3家企业检出的杂质种类不同。建议企业可根据合成工艺确定杂质种类，制定内控标准。

[1] The United States PharmacopeialConventipon. U. S. Pharmacopeia 36th Revision[S].

[2] 宁章勇. 新型兽药-环丙氨嗪[J]. 兽药与饲料添加剂, 2001, 6(4): 18-19.

[3] 中国兽药典委员会.兽药国家标准(化学药品、中药卷第一册)[S].

[4] 赵富华. 薄层色谱法检测环丙氨嗪中5种有关物质[J]. 中国兽药杂志, 2004, 38 (12):13-15.

(编辑：侯向辉)

Gradient HPLC Determination of Related Substances in Cyromazine

LU Chun-bo1, WANG Xia2, ZHANG Hang-jun1, MU Lin1

(1.ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou310012,China；2.ZhejiangGuobangPharmaceuticalCoLtd,Shaoxing，Zhejiang312500,China)

To develop a gradient HPLC method for the determination of related substance in cyromazine，the chromatographic column was Agilent Eclipse plus C18(250 mm ×4.6 mm, 5 μm) was used, the mobile phase consisted of 0.02 mol/L ammonium acetate (A) and methanol (B)with gradient program. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was at 213 nm. The results showed good separation of cyromazine from five impurities. The method is simple and sensitive for the impurity detection of cyromazine.

cyromazine; related substances; gradient HPLC

陆春波，高级兽医师，从事兽药检验和质量标准研究。E-mail: 2586064747@qq.com

2016-04-07

A

1002-1280 (2016) 06-0048-04

S859.83