丝状真菌里氏木霉中shRNA沉默红色荧光基因

李洁璇，刘雯莉，梁智成，王绍文，梁秀怡，佘炜怡，刘刚，田生礼*

(1.深圳大学生命科学与海洋学院深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060; 2.深圳市海洋生态与生物资源重点实验室深圳大学，广东深圳518060)

丝状真菌里氏木霉中shRNA沉默红色荧光基因

李洁璇1，刘雯莉1，梁智成2，王绍文2，梁秀怡1，佘炜怡1，刘刚1，田生礼1*

(1.深圳大学生命科学与海洋学院深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060; 2.深圳市海洋生态与生物资源重点实验室深圳大学，广东深圳518060)

报道了在里氏木霉中建立的一种以红色荧光蛋白(DsRed)为报告基因的RNA干扰方法。首先，将构建的表达DsRed质粒pANRed1转化里氏木霉QM9414，得到抗潮霉素B抗性并能稳定表达DsRed的菌株DsRed-T.reesei。其次，以丙酮酸脱氢酶启动子Ppdc和纤维二糖水解酶I终止子cbh I为原件，克隆到载体pPHL上构建质粒pPHL-Ppdc-Tcbh1。根据DsRed基因序列设计特定的siRNA干扰序列和另一条无同源序列的siRNA作为阴性对照，克隆到载体pPHL-Ppdc-Tcbh1得到重组质粒。将其转化到DsRed-T.reesei中，用含有100 μg/mL潮霉素B和250 μg/mL腐草霉素的PDA平板筛选转化子。结果表明，约79%的转化子出现红色荧光沉默现象，其中一些转化子DsRed的表达几乎完全被抑制。荧光定量PCR和Western印迹分析显示DsRed基因的表达受到不同程度的下调。以上结果提示，在里氏木霉中可用此方法研究基因表达调控。

RNA干扰;shRNA;红色荧光蛋白DsRed;里氏木霉

KeywordsRNA interference;shRNA;DsRed;Trichoderma reesei

里氏木霉是一种丝状真菌，广泛应用于水解酶的生产［1］，在生物降解中具有十分重要的作用。里氏木霉主要生产纤维素酶和纤维二糖水解酶I (CBHI)，能合成大约64%～80%的胞外蛋白［2］。……