TFHL对慢性脑缺血大鼠海马Caspase-3、TNF-α、IL-1β的影响*

吴晓光，李蒙蒙，杜 畅，苗光新

（1.承德医学院，河北承德 067000;2.承德医学院2012级麻醉本科;3.承德医学院2012级护理本科）

基础医学

TFHL对慢性脑缺血大鼠海马Caspase-3、TNF-α、IL-1β的影响*

吴晓光1，李蒙蒙2，杜 畅3，苗光新1

（1.承德医学院，河北承德 067000;2.承德医学院2012级麻醉本科;3.承德医学院2012级护理本科）

目的:探讨山楂叶总黄酮(TFHL）对慢性脑缺血大鼠海马Caspase-3、TNF-α和IL-1β的影响。方法:SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、TFHL组和银杏叶片组，采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备慢性脑缺血模型。免疫组化法检测大鼠海马Caspase-3蛋白的表达，ELISA法检测海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α）、白介素1β(IL-1β）的含量。结果:与模型组比较，TFHL组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达和TNF-α、IL-1β的含量明显降低(P＜0.05）。结论:TFHL对慢性脑缺血大鼠脑组织具有保护作用，其机制可能与TFHL减轻炎症反应、下调Caspase-3蛋白表达有关。

山楂叶总黄酮(TFHL）;慢性脑缺血;Caspase-3;肿瘤坏死因子-α(TNF-α）;白介素1β(IL-1β）

慢性脑缺血导致的神经细胞凋亡是脑神经功能障碍的主要原因[1]。半胱天冬酶(Caspase)是一类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族，其中Caspase-3是最主要的成员之一，可激活特定信号通路，导致细胞出现核皱缩、DNA片段形成等凋亡现象，控制着细胞凋亡的发生和发展[2]。山楂叶总黄酮(TFHL）具有抑制胆碱酯酶活性，调控PI3K/Akt信号通路等脑保护作用[3-4]，但对脑缺血后Caspase-3及炎症反应的影响未见报道。本研究旨在通过观察慢性脑缺血大鼠脑组织Caspase-3、TNF-α和IL-1β的变化，探讨TFHL脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 山楂叶总黄酮(TFHL，承德颈复康药业有限公司），纯度58%，用0.5%碳酸氢钠溶液稀释成浓度为140mg/ml;银杏叶片(扬子江药业有限公司）;Caspase-3兔抗大鼠单克隆抗体、TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司）。

1.2 实验动物与分组 SPF级SD大鼠48只，体质量230-250g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证:scxk(京）2014-0004）。大鼠适应性饲养一周 后随机分为假手术组、慢性脑缺血模型组、TFHL组和银杏叶片组，每组12只。整个实验过程符合国家善待实验动物伦理法的要求。

1.3 动物模型制备及给药 采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立慢性脑缺血模型。术后24h内未苏醒者剔除，并及时补遗。假手术组大鼠仅用玻璃分针游离出双侧颈总动脉，不做结扎处理。术后第30d开始，TFHL组给予TFHL(140mg/kg/d）灌胃、银杏叶片组给予银杏叶片（6.5mg/kg/d）灌胃，均连续30d;假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃。

1.4 免疫组化法检测Caspase-3蛋白的表达 末次给药12h后，每组随机选取6只大鼠，4%水合氯醛麻醉，10%甲醛心脏灌流固定，取视交叉后2mm-8mm的脑组织，常规石蜡包埋，5μm厚冠状切片。SP免疫组化法检测大鼠海马Caspase-3蛋白的表达(一抗工作浓度1:200），DAB显色，苏木素复染细胞核，光镜下观察、摄片。Image pro plus 5.0图像分析系统分析阳性产物面积的百分比值。

1.5 检测海马组织TNF-α、IL-1β的含量 每组余下的6只大鼠，冰台上断头取脑，分离海马，4℃生理盐水冲洗残留血液，分析天平称重，加入9倍体积的预冷生理盐水，组织匀浆器匀浆，ELISA法测定TNF-α、IL-1β的含量。

1.6 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件处理数据，组间计量资料的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达 Caspase-3蛋白免疫阳性产物位于海马神经元的细胞核。与假手术组比较，模型组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达明显升高(P＜0.01）。与模型组比较，银杏叶片组、TFHL组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达明显降低(P＜0.01）;银杏叶片组与TFHL组大鼠海马Caspase-3蛋白表达比较，差异无统计学意义(P＞0.05）。见附图，附表。

附图 各组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达（×400;A.假手术组，B.模型组，C.银杏叶片组，D.TFHL组）

2.2 各组大鼠海马TNF-α和IL-1β的含量 与假手术组比较，模型组大鼠海马TNF-α和IL-1β的含量明显升高(P＜0.01）。与模型组比较，银杏叶片组、TFHL组大鼠海马TNF-α和IL-1β的含量明显降低(P＜0.01）;银杏叶片组与TFHL组大鼠海马TNF-α和IL-1β含量比较，差异无统计学意义(P＞0.05）。见附表:

附表 各组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达和TNF-α、IL-1β的含量(±s， n=6）

附表 各组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达和TNF-α、IL-1β的含量(±s， n=6）

与假手术组比较:*P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.01

组别 Caspase-3蛋白表达 TNF-α(ng/10mg） IL-1β(ng/10mg）假手术组 0.974±0.064 16.21±2.13 20.14±1.79模型组 2.387±0.171* 27.82±6.57* 29.43±5.26*TFHL组 1.677±0.164# 19.61±3.61# 24.41±2.56#银杏叶片组 1.651±0.154# 18.79±3.43# 23.79±2.41#

3 讨论

脑组织持续性缺血缺氧诱发神经元凋亡是梗死灶扩大和迟发性神经元损伤的主要机制之一。Caspase-3是Caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在神经发育乃至脑缺血等神经系统疾病的病理生理过程中发挥着重要作用[5]。脑缺血损伤可激活Caspase-3蛋白，从而启动细胞凋亡，是引起缺血性脑损伤的重要因素，药物干预可以抑制细胞凋亡，改善神经功能[6]。TNF-α和IL-1β是损伤信号诱导下被激活的巨噬细胞所释放的前炎性因子，具有广泛的生物学功能。研究表明，缺血脑组织TNF-α和IL-1β的含量较正常脑组织明显增多，TNF-α和IL-1β的快速大量表达可以加剧血管炎症反应，促进缺血和脑水肿的发生;增加缺血后兴奋性神经递质的释放，诱导细胞坏死并加重早期脑梗死[7]。亦有研究发现，TNF-α和IL-1β可通过死亡受体通路和线粒体凋亡通路参与脑缺血后的细胞凋亡[8]。

本研究显示，慢性脑缺血能诱导大鼠海马CA1区Caspase-3蛋白表达增加，海马组织TNF-α、IL-1β含量升高，与其他学者的报道一致[9]。山楂叶总黄酮(TFHL）药物干预后，大鼠海马Caspase-3蛋白的表达显著降低，炎症反应因子TNF-α和IL-1β的含量明显下降，提示山楂叶总黄酮可能通过抑制慢性脑缺血诱导的Caspase-3的过度表达以及减轻炎症反应，发挥保护缺血脑组织的作用。

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EFFECTS OF TFHL ON CASPASE-3, TNF-Α AND IL-1Β IN HIPPOCAMPUS OF CHRONIC CEREBRAL ISCHEMIA RATS

WU Xiao-guang, LI Meng-meng, DU Chang, et al
(Chengde MedicaL CoLLege, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the inf uences of total f avone of hawthorn leaf (TFHL) on Caspase-3, TNF-α and IL-1β in hippocampus of chronic cerebral ischemia rats.Methods:Male SPF SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group, TFHL group and Ginkgo leaf tablets group. Permanent bilateral carotid artery ligation was used to establish chronic cerebral ischemia rats’ model. Immunohistochemical stain was used to detect the Caspase-3 protein expression in hippocampus; ELISΑ to detect the TNF-α and IL-1β content in hippocampus.Results:Compared with model group, Caspase-3 protein expression, TNF-α and IL-1β content in hippocampus of rats in TFHL group declined obviously (P＜0.05).Conclusions:TFHL has protective effects on brain tissue of chronic cerebral ischemia rats, the mechanisms maybe concerned with reducing inf ammatory reaction and down regulation of Caspase-3 protein expression.

Total f avone of hawthorn leaf (TFHL); Chronic cerebral ischemia; Caspase-3;TNF-α;IL-1β

R965

A

1004-6879(2016）03-0271-03

2015-11-25）

* 河北省科技厅资助项目(15277789D),河北省教育厅青年基金项目(QN2014103),

河北省高校“病理生理学”省级重点学科建设项目资助,河北省中医药抗痴呆重点研究室建设项目资助