GRP78、GRP94及CHOP在亚砷酸钠致肝损伤过程中的表达变化

李建勋 李艳 何阳 韩冰

(1.武警贵州省总队离职干部休养所，贵州 贵阳 550002;2.贵阳市公共卫生救治中心,贵州 贵阳 550002；3.贵阳市第一人民医院，贵州 贵阳 550001；4.贵州医科大学病理生理学教研室，贵州 贵阳 550025)

·论 著·

GRP78、GRP94及CHOP在亚砷酸钠致肝损伤过程中的表达变化

李建勋1李艳2何阳3韩冰4△

(1.武警贵州省总队离职干部休养所，贵州 贵阳 550002;2.贵阳市公共卫生救治中心,贵州 贵阳 550002；3.贵阳市第一人民医院，贵州 贵阳 550001；4.贵州医科大学病理生理学教研室，贵州 贵阳 550025)

目的 观察亚砷酸钠致肝损伤过程中肝脏内GRP78、GRP94及CHOP的表达变化并探讨其在亚砷酸钠致肝损伤中的可能作用。方法 Wistar大鼠20只，随机分为正常组及亚砷酸钠组，每组各10只。亚砷酸钠组大鼠自由饮用含200 mg/L的NaAsO2自来水制备砷中毒致肝损伤模型，正常组大鼠则自由饮用自来水，时间为8周。采用免疫组织化学技术检测肝组织中GRP78、GRP94及CHOP蛋白的表达变化；采用PCR技术检测肝脏中GRP78、GRP94及CHOP mRNA的变化；同时应用TUNEL法检测肝细胞凋亡。结果 免疫组织化学技术检测发现亚砷酸钠组大鼠肝脏中GRP78、GRP94及CHOP 在蛋白水平的表达较正常组大鼠显著增加(P<0.05)；PCR检测结果显示亚砷酸钠组大鼠肝脏中GRP78、GRP94及CHOP mRNA的表达也较正常组显著增加(P<0.05)；此外与正常组比较，亚砷酸钠组大鼠肝脏中肝细胞凋亡明显增多(P<0.05)。结论 GRP78、GRP94及CHOP在基因及蛋白水平表达上调可能参与了亚砷酸钠致肝损伤的发生发展过程。

砷中毒； 肝损伤； 葡萄糖调节蛋白78； 葡萄糖调节蛋白94； CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白

我国是砷中毒最为严重的国家之一，目前病区人口达300多万，砷中毒已被列入国家“十五”、“十一五”和“健康中国2020行动计划”中重大防治疾病。现有的流行病学调查和研究显示砷中毒主要以肝脏和皮肤损害为主[1]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指在病因作用下引起大量错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网腔内聚集，从而导致细胞内质网的生理功能发生严重紊乱的一种亚细胞器病理过程[2]。ERS 与多种肝脏疾病之间存在密切关系，但其与砷中毒导致的肝损伤是否有关，目前国内外报道较少。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)及葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein 94, GRP94)是广泛分布于内质网的分子伴侣，其主要作用是协助蛋白质的正确折叠、装配和运输[3]。在ERS条件下，GRP78及GRP94的合成呈显著增加趋势，因此GRP78及GRP94表达增高可以作为ERS发生的标志性蛋白[4]。CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(homologous protein，CHOP)是内质网应激蛋白GRP78下游的信号分子，在ERS介导的细胞凋亡中发挥重要作用[5]。本研究采用亚砷酸钠(NaAsO2)复制砷中毒大鼠动物模型，观察各组大鼠肝组织中GRP78、GRP94及CHOP的表达变化，并探讨上述指标在砷致肝损伤中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 实验试剂 兔抗大鼠多克隆GRP78、GRP94及CHOP抗体(武汉博士德公司)；免疫组化链酶亲和素-生物素-酶复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色剂(北京中杉金桥公司)；TUNEL检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；SYBR Green及逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；亚砷酸钠(美国Sigma公司)；β-actin、GRP78、GRP94及CHOP引物(上海生工生物工程有限公司)。β-actin：上游5’-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3’，下游5’-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’；GRP78：上游5’-TGGAATCTTCACCTCAGAGTG-3’，下游5’-ATATCCAAGGTGAACACACAC-3’；GRP94：上游5’-ACTGTTGAGGAGCCCATGGAGG-3’，下游5’-GCTGAAGAGTCTCGCGGGAAAC-3’；CHOP：上游5’-CCTCGCTCTCCAGATTCCA-3’，下游5’-CTCATTCTCCTGCTCCTTCTCC-3’。

1.2 砷中毒模型制备 雄性Wistar大鼠，体质量190～200 g，随机分为正常组及砷中毒组，每组各10只大鼠。砷中毒组大鼠给予含200 mg/L的NaAsO2自来水自由饮用以制备砷中毒模型，造模时间为8周；正常组大鼠则自由饮用自来水。在第8周末处死各组大鼠，取每只大鼠相同部位的肝叶固定于4%中性甲醛溶液中以备进行组织病理学检查及免疫组化检测，其余肝组织保存于-80 ℃低温冰箱中以备进行PCR检测。

1.3 实验指标的检测方法

1.3.1 肝组织病理学检查 每只大鼠相同部位的肝组织经4 %多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋、切片及HE染色，在光学显微镜下观察肝脏的组织病理学改变。

1.3.2 肝组织免疫组化检测 肝组织石蜡切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡水化后，在3% H2O2溶液中室温放置10 min封闭内源性过氧化物酶；随后经微波修复抗原后，滴加封闭液室温放置20 min，甩掉多余的封闭液后滴加兔抗大鼠GRP78、GRP94及CHOP一抗 (工作浓度为1∶100)，置于4℃冰箱内孵育过夜。次日加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30 min后用PBS洗3次，加SABC工作液，DAB显色，苏木素复染细胞核。阴性对照以PBS 缓冲液代替一抗。随机抽取5个高倍镜视野，观察GRP78、GRP94及CHOP阳性表达的定位及阳性细胞的百分比。

1.3.3 Real-time PCR 检测 从肝组织中提取总RNA，应用梯度PCR仪逆转录合成cDNA，随后进行Real-time PCR 反应，反应体系：10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板 4 μL，2×SYBR Green I 12.5 μL， RNase-free H2O 6.5 μL。反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，最后两步重复40个循环。

1.3.4 TUNEL法检测细胞凋亡 严格按照试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 肝组织病理学改变 正常大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无肝细胞变性、坏死；砷中毒大鼠肝小叶结构破坏,汇管区有少许炎症细胞浸润，肝细胞有不同程度的气球样变性。大鼠肝组织病理学改变见图1。

正常组(×400) 砷中毒模型组(×400)图1 大鼠肝组织病理学改变(HE染色)

2.2 肝脏中GRP78、GRP94及CHOP蛋白的表达 正常组大鼠肝脏中鲜有GRP78、GRP94及CHOP阳性表达的细胞，而砷中毒组大鼠肝脏内可见大量胞浆呈棕黄色染色的阳性表达细胞，砷中毒大鼠肝脏内GRP78、GRP94及CHOP阳性表达均较正常组显著增多,见表1，图2。

表1 肝脏中GRP78、GRP94及CHOP蛋白的表达(±s，n=10)

注：与正常组比较，*P<0.05；与正常组比较，▲P<0.01。

2.3 肝脏中GRP78、GRP94及CHOP mRNA表达 与正常组大鼠比较，砷中毒组大鼠肝脏中GRP78、GRP94及CHOP mRNA的表达均较正常组大鼠显著增加，见表2。

表2 大鼠肝脏中GRP78、GRP94及CHOP mRNA表达(±s)

注：与正常组比较，*P<0.05；与正常组比较，▲P<0.01。

2.4 肝脏中细胞凋亡情况 TUNEL法检测细胞凋亡结果显示，细胞核呈明亮黄绿色染色的细胞为凋亡细胞。正常组大鼠肝组织中仅有少量鲜有凋亡的肝细胞；而砷中毒组大鼠肝脏中肝细胞凋亡的数目较正常组大鼠明显增多。

3 讨 论

燃煤型砷中毒和饮水型砷中毒是我国环境砷中毒的两大主要类型。慢性砷中毒患者的主要表现为皮肤病变以及对各器官、系统的影响[6]。研究[7]发现，无机砷的甲基化是机体内砷降解代谢的主要途径且被摄入体内的砷主要分布在肝脏, 而肝脏为无机砷甲基化代谢的主要器官, 因此，肝脏是砷的毒性作用的主要靶器官之一。研究[8]表明，慢性砷暴露可引起不同程度的肝损伤、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。内质网是细胞内重要的细胞器，是蛋白质合成的主要场所[9]。当各种致病因素作用于机体，引起大量错误折叠蛋白或未折叠蛋白在内质网腔内大量聚集时，就可通过相应的信号通路引发细胞的内质网应激反应[10-11]。研究[12]证实药物性肝病、病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等肝脏疾病的发生均与内质网应激介导的细胞凋亡有关。但关于内质网应激与砷致肝损伤之间的关系目前国内外报道较少。

本次研究发现，大鼠自由饮用含砷水8周后，肝细胞发生不同程度的脂肪样变性，汇管区有少量炎性细胞浸润，提示给与200 mg/L剂量的含砷水饮用8周已经导致染砷大鼠肝脏发生明显的损伤。此外，在研究中还发现砷中毒大鼠肝脏中GRP78和GRP94在基因及蛋白水平的表达较正常组大鼠显著增加，由于GRP78和GRP94是ERS的标志性蛋白，因此它们在基因及蛋白水平的表达上调说明在砷致肝损伤的过程中存在肝细胞ERS反应。ERS时可通过激活未折叠蛋白反应保护细胞免受有害因素的损伤，恢复细胞的功能，因此，适度的ERS有利于细胞的存活；但是如果损伤过于严重，或细胞内环境稳定不能及时恢复，此时ERS则诱导细胞凋亡的发生。持续的ERS时，表达增多的GRP78 和GRP94可通过三个内质网跨膜蛋白PERK、IRE-1和ATF6启动下游信号分子CHOP蛋白的表达。CHOP是一个特异性的内质网应激转导因子，属于CCAAT增强结合蛋白转录因子家族成员。有研究发现，持续的ERS时CHOP表达增加可促进细胞凋亡的发生。

本次研究发现，大鼠染砷8周后，肝组织中CHOP基因及蛋白的表达显著高于正常对照组大鼠，结合本次研究发现的砷中毒组大鼠肝细胞凋亡明显增加，因此我们推测，在砷致肝损伤过程中，持续存在的内质网应激可能通过促进CHOP基因及蛋白的表达加速肝细胞凋亡的发生，从而促进肝损伤的发生发展。

(本文图2见封三)

[1] 孙贵范．关注慢性砷暴露对健康危害的研究进展[J]．中华地方病学杂志, 2014, 33(1): 1-2.

[2] 祝筱梅, 刘秀华. 内质网应激与缺血再灌注损伤及其防护[J]. 国际病理科学与临床杂志, 2006, 26(2) : 177-181.

[3] Adachi T, Kaminaga T, Yasuda H, et al. The involvement of endoplasmic reticulum?stress in bile acid-induced hepatocellular injury[J]. J Clin Biochem Nutr， 2014, 54(2):129-135.

[4] 卓德祥, 唐朝枢, 李载权. 内质网应激反应基因表达调控的多样性[J]. 医学分子生物学杂志, 2006, 3(1):32-35.

[5] 杜锡潮, 韩冰, 谢汝佳, 等. 肝纤维化大鼠肝脏中内质网应激相关分子CHOP和TRB3的表达变化[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(5):906-912.

[6] 黄晓欣, 张爱华, 杨大平, 等．燃煤型砷中毒患者临床特征、多系统损害及其意义[J]．中国地方病学杂志, 2002, 21(6)：490-493.

[7] 曹立, 郭小娟．慢性砷暴露与砷毒性的研究新进展[J]．医学综述, 2014, 20(17)：3161-3163.

[8] 李媛媛, 高彦辉, 赵丽军, 等．砷暴露致大鼠肝脏损伤的病理形态学研究[J]．中国地方病学杂志, 2011, 30(10)：68.

[9] Jiang ZQ, Yao ZH, Deng ZT, et al. Study on antagonistic effect of liangxue huayu recipe on endoplasmic reticulum stress-induced L02 hepatocyte apoptosis and its mechanism[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi， 2013, 38(20): 3544.

[10] 温静静, 谢汝佳, 韩冰, 等. 肝纤维化大鼠肝细胞内质网形态及GRP78表达的研究[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(11):2210-2213.

[11] 谢加力, 李俊, 黄艳, 等. 大鼠肝纤维化进程中内质网应激相关蛋白的动态变化研究[J]. 安徽医科大学学报, 2012, 47(9): 1028-1032.

[12] 王洪岩, 刘晓珺, 杜雅菊, 等. 内质网应激与肝脏疾病研究进展[J]. 世界华人消化杂志, 2012, 20(6): 451-459.

Change of mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP in the process of sodium arsenite-induced liver injury

LiJianxun1,LiYan2,HeYang3,HanBing4△.

1.SanatoriumforRetiredCadresofArmedPoliceCorpsofGuizhouProvince,Guiyang550002; 2.GuiyangPublicHealthCenter，Guiyang550002; 3.TheFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550002; 4.DepartmentofPathophysiology,GuizhouUniversityofMedicalScience,Guiyang550025,China.

Objective To measure the change of mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP in the process of sodium arsenite-induced liver injury and further to explore their possible roles in liver damage. Methods 20 Wistar rats were randomly divided into normal control group and arsenic poisoning model group, 10 in each group. For the next 8 weeks, the rats in model group were fed with tap water containing 200mg/L NaAsO2for the establishment of arsenic poisoning model, while the rats in control group were fed with tap water. mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP were detected by real-time PCR and immunohistochemical techniques, respectively. Meanwhile, cell apoptosis in liver was detected by TUNEL. Results Compared with normal control group, both mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP in rats of arsenic poisoning model group increased significantly (P<0.05). Besides, the apoptosis of hepatocytes in arsenic poisoning model group was elevated (P<0.05). Conclusion The up-regulating of mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP might play important roles in the process of sodium arsenite-induced liver injury.

Arsenic poisoning； Liver injury； GRP78； GRP 94； CHOP

国家自然科学基金资助(编号：81100284)

R363

A

1000-744X(2016)01-0003-03

2015-09-18)

△通信作者，E-mail：hanbing791203@163.com