载体介导shRNA对胃癌细胞株MKN45中C—met的抑制作用

黄志盛　何海萍　梁锐彬

【摘要】 目的 探讨载体介导短发夹核糖核酸（shRNA）对胃癌细胞株MKN45中原癌基因C-met的抑制作用。方法 9株胃癌细胞株分为转染组、阴性对照组和空白对照组， 各3侏。通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术， 观察转染24 h和48 h后， 原癌基因C-met的信使核糖核酸（mRNA）的CT值的变化；通过免疫印迹试验（Western blot）， 观察转染后C-met的蛋白变化；通过四氮唑盐MTT比色法， 计算细胞存活率。结果 载体介导的C-met shRNA转染24 h和48 h后， RT-PCR结果显示， C-met的mRNA抑制率分别为56%和88%；与空白对照组比较， C-met的蛋白表达水平明显下降， 转染后24 h [（0.812±0.105） VS （0.640±0.011）]、48 h[（0.811±0.103） VS （0.331±0.009）]， 差异均有统计学意义（P<0.05）；MTT比色法显示， 细胞存活率均有明显下降， 转染后24 h为65.9%， 48 h为59.6%。结论 载体介导的C-met shRNA不仅可降低胃癌细胞株MKN45中原癌基因C-met的mRNA及其蛋白表达水平， 而且对癌细胞的存活有明显的抑制作用。

【关键词】 载体介导；胃癌；信使核糖核酸；原癌基因C-met

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.05.015

Inhibiting effect by vector-mediated shRNA on C-met in stomach cancer cell strain MKN45 HUANG Zhi-sheng， HE Hai-ping， LIANG Rui-bin. Department of Gastroenterology， Guangzhou City Panyu District Shawan Peoples Hosptal， Guangzhou 511400， China

【Abstract】 Objective To investigate inhibiting effect by vector-mediated short hairpin RNA （shRNA） on proto-oncogene C-met in stomach cancer cell strain MKN45. Methods A total of 9 stomach cancer cell strains were divided into transfection group， negative control group and blank control group， with 3 strains in each group. Real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was applied to observe changes of CT value of messenger ribonucleic acid （mRNA） in proto-oncogene C-met after 24 and 48 h of transfection. Western blot was used to observe changes of protein in C-met after transfection. Tetrazolium-based colorimetric assay （MTT） was applied to calculate cell survival rate. Results In 24 and 48 h after vector-mediated mRNA shRNA transfection， RT-PCR showed mRNA inhibition rates by C-met were respectively 56% and 88%. Comparing with the blank control group， C-met had obviously reduce protein expression level， as [（0.812±0.105） VS （0.640±0.011）] in 24 h after transfection and [（0.811±0.103） VS （0.331±0.009）] in 48 h after transfection. Their differences all had statistical significance （P<0.05）， MTT showed obviously decreased cell survival rate， as 65.9% in 24 h after transfection and 59.6% in 48 h after transfection. Conclusion Vector-mediated C-met shRNA can not only reduce mRNA and its protein expression in proto-oncogene C-met of stomach cancer cell strain MKN45， and also show remarkable inhibiting effect for survival of cancer cell.

【Key words】 Vector-mediated； Stomach cancer； Messenger ribonucleic acid； Proto-oncogene C-met

据Roder[1]报道， 我国为胃癌的高发地区。有研究发现[2]， RNA干扰是人为引入与内源靶基因具有相同序列双链RNA， 诱导内源靶基因的mRNA降解， 达到阻止基因表达的目的。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 胃癌细胞株MKN45购自上海市消化疾病研究所（共9株）；实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自美国Promega公司；小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）一抗、小鼠抗人C-met一抗、辣根过氧化物物酶标记兔抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司； C-met shRNA和阴性对照购自美国OPEN-BIOSYSTEMS公司。

1. 2 方法 实验分组：转染组（转染shRNA）、阴性对照组（转染错义序列）和空白对照组（未转染shRNA）， 各3株。细胞转染， RT-PCR检测各组的C-met的 mRNA表达， 读取每孔的CT值[3， 4]， 计算各分组目的基因相对定量值。Western blot法检测C-met的蛋白表达：收集各分组细胞， 加入稀释过的抗体（小鼠抗人β-actin一抗1∶150、小鼠抗人C-met一抗1：150）4℃孵育过夜， 漂洗后加入辣根过氧化物物酶标记兔抗小鼠二抗， 化学发光法显色， 用目的蛋白C-met A值与内参β-actin A值的比值分析[5]。MTT比色试验法检测490 nm的吸收值（A）， 计算细胞存活率[6， 7]。

1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 RT-PCR检测C-met的mRNA表达情况 RT-PCR结果显示， C-met的mRNA抑制率分别为56%和88%；RT-PCR检测各组C-met的mRNA表达水平见表1。

2. 2 Western blot检测C-met 的蛋白表达水平 与空白对照组相比， 转染C-met shRNA 24 h MKN45细胞中的C-met蛋白含量（0.640±0.011）和48 h MKN45细胞中的C-met蛋白含量（0.331±0.009）显著降低， 差异均有统计学意义（P<0.05）；而阴性对照组C-met蛋白含量分别为（0.809±0.101）、（0.808±0.104）和空白对照组C-met蛋白（0.812±0.105）、（0.811±0.1033）无明显抑制， 差异无统计学意义（P>0.05）。

2. 3 MTT试验结果 转染后MTT法检测胃癌细胞株MKN45的细胞存活率， C-met shRNA转染24 h后存活率为65.9%、转染48 h后存活率为59.6%， 均低于阴性对照组的96.3%、98.4%。

3 讨论

鉴于原癌基因C-met在胃癌的发生和发展中的重要作用及RNAi技术在肿瘤基因治疗中的巨大潜在价值。RNAi技术可有效沉默胃癌细胞株中的原癌基因C-met的表达， 诱导肿瘤细胞的凋亡， 但研究多数采用的是siRNA或者miRNA技术。本研究应用shRNA技术， 通过沉默原基基因C-met的表达， 降低肿瘤细胞的存活率， 诱导肿瘤细胞凋亡。

本研究采用的C-met shRNA， 简单、易操作， 而且该C-met shRNA转染高， 其设计的沉默序列可保证有效、有针对性地沉默肿瘤细胞中的C-met的表达。本研究通过RT-PCR、Western blot和MTT实验结果可知， C-met shRNA成功沉默原癌基因C-met， 致使其mRNA及蛋白表达明显下降， 并使肿瘤细胞存活率下降， 成功诱导胃癌细胞凋亡；比较转染C-met shRNA 24 h及48 h结果可知， 随着转染时间的增长， C-met shRNA沉默作用也增强；而比较空白对照组和阴性对照组结果可知， 介导转染细胞的载体对原癌基因C-met无直接抑制作用， 关键在于C-met shRNA的直接抑制作用。

参考文献

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[5] Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） method. Mothods， 2001， 25（4）：402-408.

[6] Wang XL， Chen XM， Fang JP， et al. Lentivirus-mediated RNA silencing of c-Met markedly suppresses peritoneal dissemination of gastric cancer in vitro and in vivo. Acta Pharmacol Sin， 2012， 33（4）：513-522.

[7] 廖晓南， 孙培春， 吴刚， 等. RNA干扰对胃癌细胞株c-Met基因的研究. 医药论坛杂志， 2011（10）：31-34.

[收稿日期：2015-10-26]